目的:通过观察中药复方冠心康对ApoE基因敲除(Apolipoprotein E-/-,ApoE-/-)动脉粥样硬化小鼠血小板活化标志物及SDF-1/CXCR4生物轴的影响,探讨冠心康防治动脉粥样硬化的作用机制。
方法:
1、对ApoE-/-小鼠喂养高脂饲料复制动脉粥样硬化模型,以C57BL/6 J小鼠饲养普通饲料作为正常对照组。将ApoE-/-小鼠随机分为模型对照组、氯吡格雷组、AMD3100组、冠心康组。ApoE-/-小鼠全程给予高脂饮食,除AMD3100组隔天腹腔注射一次外,其余每组每日灌胃一次,连续灌胃12周后,摘除眼球取血,分离主动脉,取股骨骨髓,分离骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor eel,EPC)。
2、采用大型生化检测仪检测各组小鼠血脂水平:血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoproteincholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C);采用流式细胞术检测各组小鼠外周血血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体(procaspase activating compound1,PAC-1)、CD40配体(Cluster Of Differentiation40Ligand,CD40L)、基质细胞源性因子1受体(C-X-C chemokine receptor, CXCR4)表达;苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察ApoE-/-小鼠主动脉病理损伤情况;采用实时荧光定量PCR技术,检测各组小鼠主动脉基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor, SDF-1)、CXCR4 mRNA表达水平;Western-blot法检测各组小鼠主动脉SDF-1、CXCR4的蛋白表达。
3、采用密度梯度离心法获取各组小鼠骨髓性EPC,并培养及鉴定;相差倒置显微镜观察各组骨髓性EPC生长情况;采用MTT法检测骨髓性EPC增殖活性,Transwell迁移法检测骨髓性EPC迁移能力,黏附试验检测骨髓性EPC黏附性;采用实时荧光定量PCR及Western-blot技术,分别检测各组骨髓性EPC CXCR4mRNA及蛋白表达水平。
结果:
1、血脂检测结果显示:与正常对照组小鼠比较,模型对照组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平均升高,HDL-C水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,冠心康组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平均降低,HDL-C水平升高(P<0.05)。HE染色观察ApoE-/-小鼠主动脉病理损伤,结果表明冠心康可延缓动脉粥样硬化的发展。
2、流式细胞术检测结果显示:与正常对照组比较,模型对照组血小板表面PAC-1、CD40L和CXCR4表达的百分比均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,冠心康组血小板表面PAC-1、CD40L和CXCR4表达的百分比均明显降低(P<0.05)。
3、RT-PCR及Western-blot技术检测结果显示:与正常对照组比较,模型对照组小鼠主动脉SDF-1、CXCR4mRNA和蛋白表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,冠心康组小鼠主动脉SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。
4、MTT法检测显示:与正常对照组比较,模型对照组吸光度(absorbance,A)值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,冠心康组A值明显降低(P<0.05)。
5、Transwell迁移法和黏附实验检测结果显示:与正常对照组比较,模型对照组细胞数/视野均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,冠心康组细胞数/视野均明显降低(P<0.05)。
6、RT-PCR及Western-blot技术检测结果显示:与正常对照组比较,模型对照组骨髓性EPC CXCR4 mRNA和蛋白表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,冠心康组小鼠骨髓性EPC CXCR4 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。
结论:中药复方冠心康具有明显的延缓动脉粥样硬化发生发展的作用,冠心康抗动脉粥样硬化的作用可能与调控血脂,抑制血小板活化,直接调控SDF-1/CXCR4生物轴,或通过抑制血小板活化间接调控SDF-1/CXCR4生物轴有关。