背景：对乙酰氨基酚(acetaminophen，AP)是临床广泛应用的解热镇痛类非处方药，也是诱导药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)的最常见原因。目前，国内外对于AP的关注多见于毒性研究，而对于其肝毒性拮抗药物的研究尚未有突破性进展。许多常用中药具有抗氧化、抗凋亡及保肝利胆等作用，因此中药是一个筛选拮抗AP肝毒性成分的天然宝库。
目的：本研究旨在筛选出若干拮抗AP肝毒性的中药活性成分，并在此基础上进一步阐明筛选得到的中药活性成分绿原酸(chlorogenic acid，CA)拮抗AP肝毒性的机制，为临床上AP的解毒以及配伍使用提供一定的理论依据，也为临床保肝活性创新药物的研究开发奠定基础。
方法：
1.在人正常肝L-02细胞上采用MTT法建立AP肝细胞毒性评价模型，并在此基础上筛选能够拮抗AP肝毒性的中药活性成分。
2.通过小鼠体内实验的血清生化指标检测、肝脏病理切片观察进一步验证筛选到的中药活性成分CA对AP肝毒性的拮抗作用。
3.针对氧应激相关的谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)抗氧化系统，采用酶活性分析、Western-blot，Realtime PCR等方法，揭示CA拮抗AP所致氧应激肝损伤的分子机理。
4.采用Tunel染色、Western blot等方法，检测CA逆转AP诱导的肝细胞凋亡及其对凋亡相关半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路的影响，揭示凋亡相关信号通路在CA拮抗AP肝毒性中的调控作用。
5.通过热板法、醋酸扭体法等体内动物实验研究CA对AP镇痛活性的增效作用；通过干酵母、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致热动物实验模型研究CA对AP解热活性的影响。
6.通过高效液相色谱法(high pressure/performance liquid chromatography，HPLC)检测金银花水提物中CA的含量，结合小鼠体内实验的血清生化指标检测、肝脏病理切片观察以及GSH抗氧化系统相关酶活力的检测，进一步研究金银花对AP肝毒性的拮抗作用。
7.采用MTT法进一步筛选金银花中其它主要活性成分对AP诱导肝毒性的拮抗作用。
结果：
1.首先在L-02细胞建立了分析评价AP肝细胞毒性的实验方法。接下去的MTT筛选实验发现，10mMAP能显著降低L-02细胞存活率(P<0.001)，CA、黄芩素、槲皮素、山奈酚、黄芩苷、麦角甾苷、大车前苷和儿茶素这8种中药成分均能显著提高AP降低的细胞存活率(P<0.001)；而芒果苷等其它31种成分对AP降低的细胞存活率无明显逆转。进一步实验发现CA、黄芩素、槲皮素等6个中药活性成分均能剂量依赖性地拮抗AP的肝细胞毒性。
2.体内实验中，血清生化指标检测发现，给予AP(300mg/kg)4h后，小鼠血清肝损伤指标谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平显著升高(P<0.001，P<0.05)；20mg/kg和40mg/kgCA预处理能显著降低给予AP后增加的ALT、AST活力(P<0.05，P<0.001)。病理切片HE染色结果显示，给予AP后小鼠肝脏出现大范围出血、大量细胞核浓缩等严重病理损伤；提前给予CA(5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)能不同程度减轻该损伤。从而在体内实验中进一步验证了CA对AP肝毒性的拮抗作用。
3.AP(300mg/kg)能显著降低小鼠肝脏内GSH含量，降低谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)等GSH抗氧化系统相关酶的活力(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；40mg/kgCA预处理则能显著升高给予AP后降低的GSH含量和GCL、GR酶活力(P<0.05，P<0.01)。蛋白电泳和基因表达分析实验发现CA联合AP给药可以增加GCLc(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLc)蛋白、基因的表达；CA还对肝内硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)抗氧化系统蛋白的表达有明显的影响。
4.Tunel染色结果发现AP明显诱导了肝细胞凋亡，而CA可以剂量依赖性的抑制AP诱导的细胞凋亡；AP能激活肝脏凋亡相关的Caspase和MAPK信号通路，而给予CA后可以明显逆转上述变化。
5.与单独给予AP相比，配伍CA能显著减少醋酸扭体实验中小鼠扭体次数、延长热板法中小鼠舔足的痛阈值，但对干酵母和LPS的致热模型则没有显著影响。
6.金银花水提物中CA的含量为2.06％；金银花水提物(350mg/kg)能显著降低AP诱导的小鼠血清ALT和AST水平的升高(P<0.01)；HE染色结果显示，金银花水提物对AP诱导的小鼠肝脏病理损伤有抑制作用。
7.MTT筛选结果还发现异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸也对AP诱导的肝细胞毒性有明显的拮抗作用。
结论：
1.体外细胞、体内动物水平均发现CA对AP诱导的肝毒性具有显著的拮抗作用，并且CA等含邻苯二酚结构的化合物是中药金银花拮抗AP肝毒性的主要活性成分。
2.CA拮抗AP诱导肝毒性的机理如下：调控肝脏氧应激相关的GSH和Trx抗氧化系统，增加机体的抗氧化能力；调控凋亡相关的Caspase和MAPK信号通路，从而抑制了AP诱导的肝细胞凋亡。
3.CA对AP的镇痛活性具有一定的协同作用，对AP的解热活性无协同作用。
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