基于急性肝损伤模型的芍药甘草方等保肝中药复方筛选技术优化及应用  学位论文  

目的:
　　根据不同肝损伤机制，制备四氯化碳(CCl4)、刀豆蛋白A(ConA)、α-萘基异硫氰酸酯（ANIT）、急性酒精性肝损伤等动物肝损伤模型，考察模型造模条件、检测方法，优化检测指标，并对各种模型的阳性药物进行筛选，明确适宜的染毒剂量、染毒时间、染毒途径、合适的阳性药物及疗效判定指标等，初步建立标准化的保肝药物筛选平台。利用相关平台，通过规范化的实验研究方法，评价痰热清注射液、芍药甘草汤等药物的保肝护肝作用，为进一步研究和开发保肝药物提供实验依据和技术支撑。
　　方法:
　　1.保肝药物活性筛选方法的技术优化
　　1.1 四氯化碳致小鼠急性化学性肝损伤模型的优化:ICR小鼠腹腔注射CCl4植物油溶液染毒，通过考察小鼠血清指标ALT、AST和TBA值的变化和病理切片、HE染色结果，研究不同性别、染毒剂量(16mg/kg、24mg/kg、32mg/kg)、染毒时间(13h、15h、17h、20h)和多种阳性药物（熊去氧胆酸、硫普罗宁及联苯双酯）对CCl4致小鼠肝损伤的影响。
　　1.2 α-萘基异硫氰酸酯致大鼠急性化学性肝损伤模型的优化:Wistar大鼠灌胃给予ANIT植物油溶液染毒，通过考察大鼠血清指标ALT、AST、TBIL、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，研究不同染毒剂量(60mg/kg、80mg/kg)、染毒时间(24h、38h、48h、62h、72h和90h)和多种阳性药物（熊去氧胆酸、硫普罗宁及联苯双酯）对ANIT致大鼠肝损伤的影响。
　　1.3 乙醇致小鼠急性肝损伤模型的优化:ICR小鼠灌胃给予乙醇染毒，通过考察小鼠血清指标ALT、AST、TG、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，研究不同染毒剂量(3156mg/kg、4734mg/kg和6312mg/kg)、染毒时间(13h、16h、19h、24h)和多种阳性药物（熊去氧胆酸、硫普罗宁及联苯双酯）对乙醇致小鼠肝损伤的影响。
　　1.4 刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤模型的优化:小鼠尾静脉注射给予ConA生理盐水溶液染毒，通过考察小鼠血清指标ALT、AST、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，研究不同品系（ICR小鼠、BALB/c小鼠、KM小鼠）、不同性别、染毒剂量(6mg/kg、8mg/kg、11mg/kg)、染毒时间(5h、6h、7h、8h、21h、48h、72h)和多种阳性药物（熊去氧胆酸、硫普罗宁及联苯双酯）对ConA致小鼠肝损伤的影响。
　　2.保肝药物的筛选与评价
　　2.1 痰热清注射液保肝作用的研究
　　2.1.1 痰热清注射液对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用:小鼠尾静脉注射给予痰热清注射液高（12mL/kg）、中(8mL/kg)、低(4mL/kg)三个剂量，给药14天后腹腔注射16mg/kg CCl4植物油溶液染毒，染毒13h后，通过考察小鼠血清指标ALT、AST、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，评价痰热清注射液对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用。
　　2.1.2 痰热清注射液对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用:大鼠尾静脉注射给予痰热清注射液高(12mL/kg)、中(8mL/kg)、低(4mL/kg)三个剂量，给药14天后灌胃给予60mg/kg ANIT植物油溶液染毒，染毒24h后，通过考察大鼠血清指标ALT、AST、TBIL、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，评价痰热清注射液对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用。
　　2.1.3 痰热清注射液对乙醇致小鼠肝损伤模型的保护作用:小鼠尾静脉注射给予痰热清注射液高(12mL/kg)、中(8mL/kg)、低(4mL/kg)三个剂量，给药14天后灌胃给予4734mg/kg乙醇纯水溶液染毒，染毒16h后，通过考察小鼠血清指标ALT、AST、TG、TBA值的变化以及病理切片、HE染色结果，评价痰热清注射液对乙醇致小鼠肝损伤模型的保护作用。
　　2.1.4 痰热清注射液对ConA致小鼠肝损伤模型的保护作用:小鼠尾静脉注射给予痰热清注射液高（12mL/kg）、中(8mL/kg)、低(4mL/kg)三个剂量，给药14天后尾静脉注射给予11mg/kg ConA生理盐水溶液染毒，染毒7h后，通过考察小鼠血清指标ALT、AST和TBA值的变化和病理切片、HE染色结果，评价痰热清注射液对ConA致小鼠肝损伤模型的保护作用。
　　2.2 芍药甘草汤保肝作用的研究
　　2.2.1 芍药甘草汤对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用:小鼠灌胃给予芍药甘草汤高(20g/kg)、中(10g/kg)、低(5g/kg)三个剂量，给药14天后腹腔注射16mg/kgCCl4植物油溶液染毒，染毒13h后，通过考察小鼠血清指标ALT、AST和TBA值的变化和病理切片、HE染色结果，评价芍药甘草汤对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用。
　　2.2.2 芍药甘草汤对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用:大鼠灌胃给予芍药甘草汤高(20g/kg)、中(10g/kg)、低(5g/kg)三个剂量，给药14天后灌胃给予60mg/kgANIT植物油溶液染毒，染毒24h后，通过考察大鼠血清指标ALT、AST、TBIL和TBA值的变化和病理切片、HE染色结果，评价芍药甘草汤对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用。
　　结果:
　　1.保肝药物活性筛选方法的技术优化
　　1.1 四氯化碳致小鼠急性化学性肝损伤模型:雄性小鼠较雌性小鼠敏感，损伤程度稳定且均一;16mg/kg、24mg/kg染毒13h，32mg/kg染毒17h，血清ALT、AST值显著升高，达到峰值;联苯双酯对于此模型ALT活性的降低作用最为显著。
　　1.2 α-萘基异硫氰酸酯致大鼠急性化学性肝损伤模型:60mg/kg、80mg/kg染毒48h，血清ALT、AST活性显著升高，达到峰值;联苯双酯对于此模型ALT活性的降低作用最为显著。
　　1.3 乙醇致小鼠急性肝损伤模型:3156mg/kg、4734mg/kg染毒16h，6312mg/kg染毒19h，血清TG活性显著升高，达到峰值;硫普罗宁对于此模型TG活性的降低作用最为显著。
　　1.4 刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤模型:BALB/c雄性小鼠对此模型较敏感且耐受性好;6mg/kg、8mg/kg染毒22h，11mg/kg染毒8h，血清ALT、AST活性显著升高，达到峰值;联苯双酯对于此模型ALT活性的降低作用最为显著。
　　2.保肝药物的筛选与评价
　　2.1 痰热清注射液保肝作用的研究
　　2.1.1 痰热清注射液对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用:痰热清注射液高、中、低三个剂量均可抑制CCl4致小鼠血清ALT、AST活性的升高，且具有统计学差异(P＜0.05)，提示痰热清注射液对CCl4所致肝损伤具有一定的保护作用。
　　2.1.2 痰热清注射液对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用:痰热清注射液高、中、低三个剂量对ANIT致大鼠肝损伤模型中血清生化酶指标升高无明显抑制作用。
　　2.1.3 痰热清注射液对乙醇致小鼠肝损伤模型的保护作用:痰热清注射液高、中剂量均可抑制乙醇致小鼠肝损伤模型血清TG值的升高，且具有统计学差异(P＜0.05)，提示痰热清注射液对乙醇所致肝损伤具有一定的保护作用。
　　2.2 芍药甘草汤保肝作用的研究
　　2.2.1 芍药甘草汤对CCl4致小鼠肝损伤模型的保护作用:芍药甘草汤高、中、低三个剂量对CCl4致小鼠肝损伤模型中血清生化酶指标升高无明显抑制作用。
　　2.2.2 芍药甘草汤对ANIT致大鼠肝损伤模型的保护作用:芍药甘草汤高剂量组可显著抑制ANIT致大鼠肝损伤模型血清ALT活性的升高，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05)，中、低剂量有抑制大鼠血清ALT活性升高的趋势，提示芍药甘草汤对ANIT所致肝损伤具有一定的保护作用。
　　结论:
　　1.根据不同肝损伤机制，考察并建立了四氯化碳(CCl4)、刀豆蛋白A(ConA)、α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)、急性酒精性肝损伤等动物肝损伤模型，优化了适宜技术方案及评价指标，初步建立了标准化的基于急性肝损伤模型的保肝药物筛选技术平台。
　　1.1 四氯化碳致小鼠急性化学性肝损伤模型中，雄性小鼠、染毒剂量16mg/kg、染毒13h可以作为观察药效作用的适宜技术参数，该模型之阳性药物可以选择联苯双酯;
　　1.2 α-萘基异硫氰酸酯致大鼠急性化学性肝损伤模型中，染毒剂量60mg/kg、染毒24h可以作为观察药效作用的适宜技术参数，该模型之阳性药物可以选择联苯双酯;
　　1.3 乙醇致小鼠急性肝损伤模型中，染毒剂量4734mg/kg、染毒16h可以作为观察药效作用的适宜技术参数，该模型之阳性药物可以选择硫普罗宁;
　　2.采用标准化的基于急性肝损伤模型的保肝药物筛选技术平台，评价了痰热清注射液、芍药甘草汤等药物的保肝护肝作用，为进一步研究和开发保肝药物提供实验依据和技术支撑。
　　2.1 痰热清注射液对CCl4、乙醇和ConA所致动物急性肝损伤具有一定的保护作用;
　　2.2 芍药甘草汤对ANIT、乙醇和ConA所致动物急性肝损伤具有一定的保护作用。