目的:探讨马兜铃酸肾病与脂质代谢之间的关系,以及马兜铃酸对离体细胞或组织中的肝型脂肪酸结合蛋白含量的影响,验证尿肝型脂肪酸结合蛋白在急性马兜铃酸肾病早期预测中的应用价值,阐述脂质积聚与急性马兜铃酸肾病的相关性。
方法:
1急性马兜铃酸肾病早期检测指标的探索
1.1建立马兜铃酸急性肾小管坏死大鼠模型,肝肾组织称重,计算脏器相对重量,检测血清总蛋白、葡萄糖、肌酐、尿素氮、血脂各项。
1.2各时间点动物肾脏切片行HE染色并在光镜下观察肾脏组织学改变,对末次给药后的动物肾脏行透射电镜观察细胞超微结构,苏丹黑B染色法检测肾组织中的脂类物质。
1.3用ELISA方法进行血清Cys C以及血清、尿液L-FABP、尿液NAG、KIM-1的检测。
1.4各时间点肾脏组织匀浆检测谷胱甘肽含量。
2马兜铃酸对肝型脂肪酸结合蛋白影响的体外研究
2.1以5×103/ml细胞浓度描绘大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK-52E)生长曲线。用0.8、8、80μg/ml不同浓度AA刺激培养NRK-52E,以普通培养基细胞作为对照组,用MTT检测AA对NRK-52E细胞活力的影响。
2.2以2.5、5、10、20、40μg/ml不同浓度AA刺激培养NRK-52E,以普通培养基细胞作为对照组,用ELISA方法检测细胞上清NAG、KIM-1、L-FABP含量;并以不同浓度AA刺激培养NRK-52E和AA刺激后不同时间检测细胞L-FABP含量。
2.3建立大鼠离体灌流肾脏模型,按5ml/min恒速灌流,空白对照组给予正常灌流液,马兜铃酸组分别给予等体积AA溶液(7mg/50ml),灌流给药10min后,不同时间点收集灌流液和尿液,分别检测钾、钠、氯离子浓度,计算离子清除率,ELISA方法检测尿液L-FABP浓度。
3脂质积聚在马兜铃酸肾病中的机制研究
3.1用实时荧光定量PCR技术检测整体动物实验末次给药后动物肾脏样品中L-FABP、PPARαmRNA水平。
3.2用免疫组化技术和蛋白免疫印迹技术对末次给药后肾脏样品进行L-FABP、PPARα蛋白分析。
结果:
1急性马兜铃酸肾病早期检测指标的初步探索
1.1 AA组动物在给药1次后体重即开始下降,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),且呈持续下降趋势。肾脏相对重量在第2、3、4次给药后增大,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。肌酐、尿素氮变化不明显。血脂检测可见AA组给药各次TG均明显降低(P<0.01),给药3、4次后TC亦明显下降(P<0.01),LDL-C给药1、2、3、4次后均升高,HDL-C给药2、3、4次后均降低(P<0.01)。
1.2第2、3、4次给药后的AA组肾组织光镜下可见典型的急性肾小管坏死表现,符合急性马兜铃酸肾病病理学改变。肝组织光镜下未见异常。电镜和苏丹黑染色均显示肾小管上皮细胞内脂滴增多,而对照组则无脂滴。
1.3血清Cys C在1、2次给药后较对照组下降,随即升高,但无统计学意义。尿液NAG和L-FABP在给药1、2、3、4次后都升高,与对照组相比有统计学意义。尿液KIM-1在给药1、3次后升高,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。
1.4 AA组在给药2、3、4次后肾组织谷胱甘肽均明显下降,与对照组相比,有统计学差异(P<0.01)。
2马兜铃酸对肝型脂肪酸结合蛋白影响的体外研究
2.1 AA对NRK-52E细胞株有抑制作用,8、80μg/ml的AA可使细胞活力分别降至85.31±10.25%,79.75±3.88%,与对照组相比,80μg/ml组有统计学意义(P<0.01)。
2.2在AA浓度为2.5-40μg/ml范围内分别给予细胞刺激培养,L-FABP在2.5μ.g/ml分泌明显增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.01),而NAG、KIM-1则变化不明显。在AA浓度为0.1-80μgml范围内,较低浓度(0.4-4μg/ml)可刺激L-FABP分泌增多,且有统计学差异,而高浓度时则其分泌相对受抑,统计学无差异。0.4μg/ml AA刺激6h L-FABP分泌达到高峰(P<0.01),持续至48h(P<0.05)。
2.3在离体灌流肾脏体系中,马兜铃酸组钾、钠离子清除率在给药后30min明显下降,分别从给药前的(99.54±14.55)%和(27.93±6.66)%下降至(33.16±9.59)%和(9.70±2.62)%,与空白对照组相比差异显著;尿L-FABP在给药灌流后即刻明显升高,从给药前(7.42±0.12)ng/L升高至(8.18±0.47)ng/L,与空白对照组相比差异显著。
3脂质积聚在马兜铃酸肾病中的机制研究
3.1 AA组L-FABP、PPARαmRNA表达上调,较对照组有统计学意义(P<0.05)。
3.2免疫组化分析显示L-FABP在正常大鼠肾脏有表达,主要定位于肾近端小管上皮细胞的胞质和胞核,而肾小球无表达,在从刺激下肾小管上皮细胞中L-FABP蛋白表达增加,与正常组相比有统计学意义。PPARα在正常大鼠肾脏皮质肾小管和肾乳头集合管的上皮细胞胞质中有阳性表达,肾小球有少量表达,皮髓交接处则表达较弱。在AA刺激下肾皮髓交界处肾小管上皮细胞的PPARα表达增加,尤其是坏死脱落的上皮细胞胞核中阳性表达明显。Western blot分析显示,AA促进了大鼠肾脏L-FABP和PPARα蛋白表达,与对照组相比,有显著统计学差异(P<0.01)。
结论:
1.急性AAN存在显著的脂质代谢紊乱,以TC、TG、HDL-C的降低和LDL-C的升高为特点。2.急性AAN病变发展过程中有脂类物质积聚发生,部位以受损的肾小管上皮细胞为主,是促进肾功能恶化的因素之一。3.尿L-FABP可以早期预测急性AAN的发生,且不受血清L-FABP的影响,是一个较敏感的反映肾损伤特异性的生物学指标。4.在急性AAN的病理进程中,通过上调PPARα和L-FABP的基因和蛋白表达水平以促进脂质代谢,是肾脏自我保护和修复作用的体现。