加味六君子汤对小鼠胃癌MFC细胞及其移植瘤的作用研究  学位论文  

目的：
　　 观察加味六君子汤作用小鼠胃癌MFC细胞后细胞的形态学变化、细胞的增殖抑制作用以及细胞周期与凋亡的变化；观察加味六君子汤对小鼠异位移植瘤的抑瘤作用，肿瘤组织的变化、瘤体细胞结构变化，通过检测细胞及瘤体组织TLR4、MyD88、NF-κB基因和蛋白表达，探讨加昧六君子汤的抑癌机理。
　　 方法：
　　 体外实验：
　　 采用中药血清药理学和体外细胞培养的实验方法观察加味六君子汤含药血清作用小鼠胃癌MFC细胞后细胞的形态变化；MTT比色法检测含药血清对MFC细胞的增殖抑制作用；流式细胞术检测含药血清对MFC细胞周期和凋亡的影响；Real Time-PCR检测含药血清作用后MFC细胞TLR4、MyD88、NF-κB基因表达；Western blotting检测含药血清作用后MFC细胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达。
　　 体内实验：
　　 普通光学显微镜观察肿瘤组织病理变化；电子显微镜观察肿瘤细胞结构变化；Real Time-PCR检测肿瘤组织TLR4、MyD88、NF-1B基因表达；Western blotting检测肿瘤组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达。
　　 结果：
　　 1.体外实验
　　 (1)细胞形态变化结果
　　 加味六君子汤含药血清作用于MFC细胞24h后，倒置显微镜下观察，对照组细胞贴壁生长，分布均匀，细胞形态饱满，相邻细胞生长融合成片；各含药血清组细胞数量减少，细胞形态不规则，部分细胞变圆，细胞间接触变松，甚至细胞脱落，脱落细胞碎片悬浮培养液中，其中以15％含药血清组最为明显，其次是10%含药血清组。
　　 (2)细胞增殖检测结果
　　 MTT测定结果显示：与相同条件下的对照组相比，5%、10%、15%含药血清组平均吸光光度值呈明显下降趋势，抑制率增强(P＜0.01)。10%、15%含药血清组平均吸光光度值低于5%含药血清组(P＜0.01)，15%含药血清组平均吸光光度值低于10%含药血清组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。含药血清作用48h与作用24h相比，抑制率增强。
　　 凋亡检测结果显示：与对照组相比，各含药血清组凋亡百分比依次增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，含药血清组组间比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 (4)细胞周期分析结果
　　 细胞周期分析结果显示：与对照组相比，5%含药血清组G2期所占比例增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，10%、15%含药血清组G2期所占比例明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，含药血清组组间比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 (5)TLR4、MyD88、NF-κBmRNA检测结果
　　 Real Time-PCR检测结果显示：含药血清作用MFC细胞24h后TLR4mRNAΔct值增高，与对照组相比，15%含药血清组TLR4mRNAΔct值增高显著，差异具有统计学意义(P＜0.01)，10%含药血清组TLR4mRNAΔct值也有所增高，但差异无统计学意义(P＞0.05)；两含药血清组间比较无统计学差异(P＞0.05)。
　　 含药血清作用MFC细胞24h后MyD88mRNAΔct值增高，与对照组相比，15%含药血清组MyD88mRNAΔct值增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，10%含药血清组MyD88mRNAΔct值也增高，但差异无统计学意义(P0.05)，两含药血清组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).
　　 含药血清作用MFC细胞24h后NF-1BmRNAΔct值增高，与对照组相比，15%含药血清组上调了细胞NF-κBmRNAΔct值，差异具有统计学意义(P＜0.05)，10%含药血清与对照组及15%含药血清组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 (6)TLR4、MyD88、NF-1B蛋白检测结果
　　 Westem blotting结果显示：含药血清作用MFC细胞24h后，与对照组相比，15%含药血清组TLR4、MyD88、NF-κB条带颜色均变浅。
　　 2.体内实验
　　 (1)肿瘤生长抑制率结果
　　 对照组、中药低剂量组、中药高剂量组的荷瘤小鼠的瘤重分别为0.51±0.08g、0.47±0.09g、0.39±0.12g，与对照组相比，中药高剂量组瘤重明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，中药低剂量组瘤重稍有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，两中药组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 (2)肿瘤组织变化结果
　　 普通光学显微镜下观察肿瘤组织变化结果显示，对照组瘤细胞分布规整，核大深染，核分裂相多见；中药低剂量组瘤细胞间有炎性细胞侵润，细胞大小不规则；中药高剂量组瘤细胞有炎性坏死，组织结构破坏，见细胞碎片。
　　 (3)瘤体细胞结构变化结果
　　 透视电镜下观察肿瘤组织细胞结构变化，结果显示，对照组瘤细胞大小均匀，边界清晰；中药低剂量组瘤细胞凋亡，细胞核向周边扩散，异染色质边集；中药高剂量组细胞大小不一，核边集，细胞核边界弥散。
　　 (4)TLR4、MyD88、NF-κBmRNA检测结果
　　 实时荧光定量PCR检测结果显示：对照组、中药低剂量组、高剂量组TLR4mRNAΔct值依次增高，与对照组相比，中药高剂量组TLR4mRNAΔct值升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，中药低剂量组与对照组及高剂量组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 MyD88mRNAΔct值依次增高，与对照组相比，中药高剂量组MyD88mRNAΔct值升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，中药低剂量组与对照组及高剂量组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 NF-κB mRNAΔct值依次增高，与对照组相比，中药高剂量组NF-1BmRNAΔct值升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，中药低剂量组与对照组及高剂量组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 (5)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白检测结果
　　 Western blotting结果显示，与对照组相比，加味六君子汤低剂量组、高剂量组TLR4、MyD88、NF-κB条带颜色依次变浅。
　　 结论：
　　 (1)加味六君子汤呈时间-剂量-依赖性抑制小鼠胃癌MFC细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞于G2/M期，从而起到抗肿瘤的作用。
　　 (2)加味六君子汤能够抑制小鼠胃癌生长，瘤重减轻，瘤体炎症坏死，细胞结构异型性。
　　 (3)加味六君子汤下调了胃癌MFC细胞TLR4、MyD88、NF-κB基因与蛋白的表达，可能是加味六君子汤抗肿瘤的机制之一。