目的:研究内皮素-1(endothelin-1，ET-1)刺激大鼠肝星状细胞(rat hepaticstellate cells，rHSCs)收缩的信号传导通路，探讨丹参酚酸B(Salvianolic acid B，SA-B)抑制ET-1诱导rHSCs收缩的作用机制。
方法:采用肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心法分离rHSCs，以胞浆内所含的典型脂滴鉴定；所有实验均以不同批次分离的传1-4代rHSCs重复3次。采用胶原凝胶收缩法检测ET-1刺激后rHSCs的收缩情况。甘油胶电泳和Odyssey检测肌球蛋白轻链2(myosin light chain2，MLC2)的磷酸化水平。相差显微镜观察SA-B及抑制剂处理后rHSCs的形态；FITC-phalloidin特异性染F-actin，观察细胞内肌动蛋白的聚合与重构。激光共聚焦显微镜观测胞浆内Ca2+浓度的变化。免疫蛋白印迹法检测肌球蛋白磷酸酶靶亚基-1(myosin phosphotasetargeting subunit-1，MYPT-1)磷酸化以及RhoGEFs、ETA和ETB的表达。RhotekinRBD结合检测活性形式的GTP-RhoA含量。特异性抗体沉淀ROCKs或肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)，进行体外磷酸化反应，以磷酸化底物Thr696-MYPT-1(654-880)或Ser19-MLC2(his tag fusion)的含量分别表示ROCKs或MLCK活性。RhoA免疫荧光染色观察其在细胞内的分布，提取膜蛋白进行免疫蛋白印迹检测膜结合RhoA的含量。
结果:ET-1可刺激体外培养活化的rHSCs收缩，并在此过程中伴随着细胞内MLC2磷酸化水平的增加。Ca2+螯合剂BAPTA-AM、MLCK抑制剂ML-7、RhoA活性抑制剂C3外毒素和ROCK抑制剂Y-27632均能抑制ET-1诱导的rHSCs收缩和MLC2磷酸化。ET-1处理后，胞浆内的[Ca2+]i升高，MLCK、RhoA和ROCKs活性增强，MYPT-1在Thr696和Thr850两个位点的磷酸化水平增加，LARG的蛋白表达增加，但p115和PDZ表达无明显变化，ETA和ETB的表达亦无改变。
SA-B预处理可抑制ET-1诱导的rHSCs收缩和MLC2磷酸化，使细胞中的F-actin骨架解聚。SA-B的这些作用是通过抑制Ca2+-MLCK和RhoA-ROCK两条通路实现的，它可以阻断ET-1刺激后胞浆内[Ca2+]i升高，抑制MLCK活性增加；抑制RhoA和ROCK II的活化，但对ROCK I活性没有影响；抑制MYPT-1在Thr696位点的磷酸化，但不影响Thr850磷酸化水平。SA-B还可以抑制ET-1刺激后LARG表达的增多，但本身对rHSCs中的LARG含量没有影响，对ETA和ETB的表达也无影响。
结论:
1.Ca2+-MLCK和RhoA-ROCK通路均参与ET-1诱导的rHSCs收缩；
2.SA-B能有效抑制ET-1诱导的rHSCs收缩，抑制MLC2磷酸化和F-actin聚合；
3.SA-B抑制了ET-1激活的Ca2+-MLCK通路:阻断胞浆中[Ca2+]i升高，抑制MLCK活性；
4.SA-B抑制了ET-1激活的RhoA-ROCK通路:降低GTP-RhoA含量，抑制RhoA活化，抑制ROCK II活化，降低MYPT-1的Thr696磷酸化水平，降低ET-1刺激引起的LARG高表达。
(8.0+极速模式)