目的:
观察低剂量蟾毒灵联合羟基喜树碱对人前列腺癌细胞株Du145体外生长的影响，探讨较好抗肿瘤作用的药物剂量及给药方式，初步研究其可能存在的作用机制。
方法:
1)体外培养原代人前列腺癌DU145细胞，并依据实验需求分为:对照组、蟾毒灵组、羟基喜树碱组、蟾毒灵+羟基喜树碱同时给药组、蟾毒灵+羟基喜树碱序贯给药组;
2)采用CCK-8法检测不同浓度的蟾毒灵和羟基喜树碱作用不同时间对DU145细胞生长的影响，并检测联合作用下不同给药方式对DU145细胞生长的影响。光学显微镜观察不同浓度及给药方式下细胞生长情况以及形态变化;
3)流式细胞术检测不同的浓度及给药方式时蟾毒灵、羟基喜树碱对DU145细胞周期和细胞凋亡率的影响;
4)采用Western Blotting技术检测蟾毒灵、羟基喜树碱单独用药及联合用药对Bcl-2家族基因及线粒体凋亡途径相关凋亡蛋白的影响。
结果:
1)不同浓度的蟾毒灵、羟基喜树碱作用于DU145前列腺癌细胞24、48、72小时后，结果发现，同一时间，药物浓度逐渐增加，蟾毒灵、羟基喜树碱对前列腺癌DU145细胞的抑制作用逐渐增强(P＜0.05);同一作用浓度条件下，随着时间的增加，蟾毒灵、羟基喜树碱对前列腺癌细胞的抑制率亦逐渐增加(P＜0.05)。
2)蟾毒灵处理前列腺癌细胞24、48、72小时后，半数抑制浓度为:(198.66±30.62nmol/L)、(44.28±6.95nmol/L)、(24.03±2.21nmol/L);羟基喜树碱处理DU145前列腺癌细胞24、48、72小时后，半数抑制浓度分别为:(0.0162±0.0028μg/mL)、(0.0016±0.0030μg/mL)、(0.0014±0.0015μg/mL)。两组IC50值对比发现:IC50值均随药物作用时间增加而减低(P＜0.05)。
3)蟾毒灵、羟基喜树碱联合用药采用不同的药物浓度及给药方式作用于DU145前列腺癌细胞，联合用药效应指数金氏公式检测结果发现:蟾毒灵联合羟基喜树碱序贯给药方式可获得对抗前列腺癌细胞的协同作用（Q值＞1.15），较低剂量的蟾毒灵(20nmol/L)+羟基喜树碱（0.01μg/mL）序贯给药作用24小时即可获得较好的协同抗肿瘤作用。
4)蟾毒灵、羟基喜树碱作用于DU145前列腺癌细胞后，观察细胞的形态、结构改变，结果发现:药物浓度的递增、作用时间的增加，细胞形态逐渐失去极性、排列稀疏、细胞核破碎、胞浆颗粒增多、存活细胞减少、死亡细胞增多，说明蟾毒灵、羟基喜树碱对前列腺癌的抑制作用呈时间-剂量双重依赖性。两药联合作用时单药组及联合用药组均可见细胞不同程度的结构改变，以序贯给药方式作用下的细胞结构上述样改变最为明显。
5)蟾毒灵、羟基喜树碱处理DU145前列腺癌细胞后，将前列腺癌细胞增殖周期分别阻滞于G2/M期和S期，进而发挥诱导前列腺癌细胞凋亡的作用。不同作用时间及给药方式处理DU145细胞后，检测细胞凋亡率发现:蟾毒灵、羟基喜树碱均可诱导DU145细胞凋亡且有时间依赖性(P＜0.05)，不同给药方式的联合用药结果显示:联合用药序贯给药组诱导前列腺癌细胞凋亡作用较强(P＜0.05)。
6)蟾毒灵处理前列腺癌细胞可下调胞内Bcl-2蛋白表达; Bax、Caspase-3、Caspase-9在肿瘤细胞内，蛋白表达增强，并有一定的时间依赖性(P＜0.05)。羟基喜树碱处理DU145细胞可减弱Bcl-2蛋白表达;Bax、Caspase-3、Caspase-9表达被上调，有时间依赖性(P＜0.05)。DU145细胞经联合用药各组药物处理24h、48h后，联合给药序贯给药组Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达水平上升，并呈时间依赖性(P＜0.05);联合用药同时给药组Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达水平变化不明显(P＞0.05)。
结论:
1)蟾毒灵和羟基喜树碱均能抑制DU145细胞增殖，通过分别阻滞DU145前列腺癌细胞增殖周期于G2/M期和S期，诱导前列腺癌细胞凋亡，抗肿瘤作用呈时间及剂量依赖性;两种药物分别作用于前列腺癌细胞后，可显著增强Bax/Bcl-2蛋白在肿瘤细胞中的比例、升高Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平，提示Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡蛋白的调节是蟾毒灵及羟基喜树碱共同的抗前列腺癌的重要机制之一。
2)低剂量蟾毒灵联合羟基喜树碱序贯给药方式，可协同抑制前列腺癌细胞增殖、增加细胞凋亡率，且效果优于单独给药，或者两药同时给药。联合用药序贯给药方式作用于前列腺癌细胞，可上调凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达，发挥较好的对前列腺癌DU145细胞的抗肿瘤作用。提示协同抗肿瘤机制可能是两药序贯作用增加了细胞毒作用并激活了细胞凋亡线粒体途径关键蛋白Caspase-3、Caspase-9。显示此种联合用药方式可降低蟾毒灵的药物浓度、减轻副作用并增强抗肿瘤效果。
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