[目的]三七花总皂苷(PNFS)提取自传统名贵中药材三七的花蕾。在传统中医药中三七花被用于治疗高血压、化疗性口腔炎、咽炎等炎症性疾病;PNFS是三七花的主要活性成分,具有显著的抗炎功效,但是PNFS的抗炎分子机制国内外尚无报导。前期研究发现PNFS具有很强的抑制炎症介质一氧化氮(NO)生成和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因过表达的效应,因此本课题旨在探讨PNFS抑制脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞iNOS基因过表达的分子机制。
[方法]通过LPS诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞活化建立细胞炎症模型。通过CCK-8实验检测PNFS对细胞的毒性浓度范围;以Griess试剂法、DAF-FM DA荧光探针实验和NO2-清除实验测定炎症介质一氧化氮(NO)含量变化;以Real-timeRT-PCR和ELISA法测定白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因表达变化;以Real-time RT-PCR和Western Blotting法分别测定诱导性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和蛋白的表达水平变化,同时检测iNOS活性变化;最后以Real-timeRT-PCR和Western Blotting法测定PNFS对TLR4介导的MAPKs、PI3K/Akt和NF-kappaB信号通路活化的影响。
[结果]
(1)与空白对照组相比,PNFS药物浓度小于200μg/ml时对RAW264.7巨噬细胞没有毒性。
(2)从6h至24h各时间点模型组相较于正常对照组NO释放量呈时间依赖性增加,而从12h开始各时间点内各PNFS组(50,100,200μg/ml) NO释放量显著低于模型组且具明显浓度依赖性,表明PNFS在12h后开始发挥药效,到24h最为明显。在24h时间点,与正常对照组比较,模型对照组NO释放量、细胞内NO荧光强度显著增高;与模型对照组相比,各PNFS组(50,100,200μg/ml) NO释放量、细胞内NO荧光强度呈浓度依赖性显著降低。此外,NO2-体外清除实验显示,各PNFS组(50,100,200μg/ml)对细胞体外NO2-没有清除作用。上述结果表明PNFS对巨噬细胞NO含量的降低作用是通过抑制细胞体内NO生成而不是通过体外清除实现的,提示PNFS在细胞体内干预了NO生成的信号通路。
(3)与正常对照组相比,模型对照组IL-6和TNF-α基因表达显著增加,与模型对照组相比,各PNFS组(50,100,200μg/ml) TNF-α基因表达没有显著差异、PNFS组(100,200μg/ml) IL-6基因表达显著降低,而PNFS组(50μg/ml)没有差异,且其对IL-6基因表达的抑制率明显低于对NO生成的抑制率。上述结果表明,PNFS主要是通过抑制炎症介质NO的生成而不是通过抑制促炎因子的生成发挥其抗炎效应的。
(4)与正常对照组相比,模型对照组iNOS基因mRNA和蛋白表达显著增高,与模型对照组相比,各PNFS组(50,100,200μg/ml)基因mRNA和蛋白表达显著降低;与正常对照组相比,模型对照组iNOS蛋白活性显著增高,与模型对照组相比,各PNFS组(50,100,200μg/ml) iNOS蛋白活性没有显著差异。上述结果表明,PNFS是通过抑制iNOS基因过表达而不是通过抑制单位iNOS蛋白酶活性来抑制巨噬细胞的NO生成。
(5)与正常对照组相比,模型对照组TLR4 mRNA表达显著增高,与模型对照组相比,各PNFS组(1OO,200μg/ml) TLR4 mRNA表达显著降低;与正常对照组相比,模型对照组p38、EKR1/2、JNK、IkappaB和p65的磷酸化水平显著增高,与模型对照组相比,PNFS组(200μg/ml) p38、EKR1/2、JNK、IkappaB和p65的磷酸化水平显著降低,但各组间p38、EKR1/2、JNK、IkappaB和p65的表达没有显著差异;此外,与模型对照组相比,PNFS组(200μg/ml) PI3K和p-Akt的表达均无明显差异。上述结果表明,PNFS是通过抑制TLR4/MAPKs/NF-kappaB信号通路而不是PI3K/P-Akt信号通路,从而抑制了iNOS基因过表达。
[结论]PNFS通过显著抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中炎症介质NO的过量生成表现出强大的抗炎功效;其抑制NO生成的分子机制主要通过下调TLR4介导的MAPKs/NF-kappaB信号通路活化,从而抑制iNOS mRNA和蛋白的表达得以实现。