飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血（Toddalia asiatica Lam,）的根，是苗族、土家族等少数民族常用的民族药之一。具有祛风止痛、化瘀止血、解毒消肿之功。现代研究表明，其化学成分复杂，具有多种药理作用，如镇痛、抗炎、抑菌、抗病毒、保护心脑血管等；所含有的白屈菜红碱、氯化两面针碱等生物碱成分具有显著的抗肿瘤活性，但含量较低；其总生物碱(Radix Toddaliae Asiaticae Total Alkaloids，RTATA)部分是否具有抗肿瘤作用国内外未见报道。本课题采用中药化学、分析化学等相关技术，研究了飞龙掌血总生物碱有效部位的制备工艺：采用体内和体外相结合的方法，从整体和细胞水平研究了RTATA抗肿瘤作用，并进行了初步的机制探讨。
目的：研究飞龙掌血总生物碱(RTATA)有效部位的制备工艺；研究RTATA抗肿瘤作用，初步揭示其作用机制，为进一步研究奠定前期基础。
方法：1.通过单因素分析和正交实验相结合的方法，考察飞龙掌血总生物碱的醇回流提取工艺，确定适宜的工艺参数。
2.比较D001SD、LSD001、732三种型号的阳离子交换树脂对飞龙掌血总生物碱的吸附、洗脱性能，确定纯化工艺。
3.通过酸性染料比色法，利用紫外分光光度计进行飞龙掌血总生物碱的含量测定，并进行方法学考察，建立适宜的含量测定方法。
4.采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)法，测定飞龙掌血总生物碱中氯化两面针碱的含量，并进行方法学考察，建立适宜的测定方法。
5.采用MTT法，研究飞龙掌血总生物碱对体外培养的人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株AGS、人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响；采用BrdU、细胞集落形成法，进一步研究飞龙掌血总生物碱对人肺癌细胞株A549增殖的影响。
6.通过体内抗抑瘤实验，研究飞龙掌血总生物碱对S180荷瘤小鼠肿瘤生长、脾脏指数、胸腺指数的影响。
7.采用流式细胞分析法，研究飞龙掌血总生物碱对人肺癌细胞株A549细胞周期的影响。
8.通过TUNEL、流式细胞术、RT-PCR等方法，研究飞龙掌血总生物碱对人肺癌细胞株A549凋亡的影响。
结果：1.确定了飞龙掌血总生物碱醇回流提取工艺的参数：70％乙醇，固液比为1:10，提取2次，每次1h。
2.确定了飞龙掌血总生物碱纯化工艺参数：优选D001SD型阳离子交换树脂作为纯化富集的载体，上样液浓度为0.1mg生药/ml，上样液pH=2，最大上样量为100ml，上样流速为1.5BV/h，洗脱剂为10%氨水-95%乙醇系统。工艺验证实验得到该有效部位含量均大于50%。
3.建立了飞龙掌血总生物碱含量测定方法：采用酸性染料比色法，检测波长为330nm，以氯化两面针碱(Nitidine Chloride)为对照品，在1.4976～5.9904μg/ml范围内对照品含量与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为Y=0.1159X+0.1376，r=0.9997(n=5)，平均回收率为100.08%。该方法回收率、稳定性、重现性、精密度良好，可用于飞龙掌血总生物碱的含量测定。
4.建立了飞龙掌血总生物碱中氯化两面针碱含量测定方法：采用RP-HPLC方法，检验波长为271nm，以氯化两面针碱为对照品，在0.010781～0.69mg/ml范围内进样量与峰面积线性关系良好。回归方程为Y=11336X+20.32，r=0.9999(n=6)，平均回收率为100.06%。该方法回收率、稳定性、重现性、精密度较好，可用于飞龙掌血总生物碱中氯化两面针碱的含量测定。
5.飞龙掌血总生物碱在0.3～100μg/ml的浓度范围内，对人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株AGS、人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖均有不同程度的抑制作用，其半数抑制浓度(IC50)均在11μg/ml以下，尤其对人肺癌细胞株A549的增殖抑制作用最为显著，IC50为3.53μg/ml。时量曲线结果显示：飞龙掌血总生物碱对人胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用具有较好的时-量-效依赖关系。BrdU、细胞集落形成法，进一步证明了飞龙掌血总生物碱对人肺癌细胞株A549的增殖具有显著抑制作用。
6.体内抑瘤实验发现：飞龙掌血总生物碱各剂量组(100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg，1～10d)对S180荷瘤小鼠的抑瘤率分别为36.63%、59.70%、65.20%。各剂量组的瘤重与阴性对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)。飞龙掌血总生物碱各剂量组的胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组比较无显著性差异，但与环磷酰胺组比较具有显著性差异(P＜0.05)，环磷酰胺组与阴性对照组比较亦有显著性差异(P＜0.05)。
7.流式细胞术分析发现：在25μg/ml和50μg/ml浓度时，飞龙掌血总生物碱能够改变人肺癌细胞株A549的细胞周期，且具有量效关系。飞龙掌血总生物碱作用后的细胞与阴性组比较，G0/G1期的细胞数量明显减少，S期细胞数量增加，因此飞龙掌血总生物碱能够将细胞阻滞于S期，从而达到诱导细胞凋亡的作用。
8.TUNEL、流式细胞术研究表明：飞龙掌血总生物碱在1～40μg/ml浓度范围内，能诱导人肺癌细胞株A549凋亡，主要表现为晚期凋亡，早期凋亡不明显。RT-PCR结果表明：飞龙掌血总生物碱能够调节P53通路及相关靶基因，且作用大多呈明显的量效关系。
结论：本实验所采用的提取分离、纯化技术，简单易行、安全有效，适合工业化生产，能够得到纯度较好的飞龙掌血总生物碱有效部位；飞龙掌血总生物碱对多种肿瘤细胞具有抑制作用，抗肿瘤作用明显。其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。飞龙掌血总生物碱作为一个民族常用药材的提取物，值得进一步开发利用。
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