目的:课题组在前期研究中筛选到一株具有抗乙酰胆碱酯酶活性的蛇足石杉内生真菌L10Q37,并从中分离得到4个活性化合物。本实验基于单菌株多产物(OSMAC,one strain-many compounds)策略,改变发酵方法,采用动静结合发酵法,对该菌株的次级代谢产物进行研究,旨在提升菌株发酵产物的多样性。
方法:原发酵方法为28℃摇床150转/min马铃薯葡萄糖培养基液体发酵10天;新发酵方法为28℃摇床150转/min马铃薯葡萄糖培养基液体发酵6天后转入室温静置培养24天。首先应用HPLC技术检测两种发酵方法次级代谢产物的差异性。随后采用新发酵方法进行大规模发酵,综合运用硅胶柱、葡聚糖凝胶LH-20柱、ODS中压柱、半制备柱等柱色谱手段分离获得单体。对所得单体进行质谱、核磁共振波谱测试,确定化合物结构。最后使用CCK-8法测试了HP1、HP4和HP5对人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞HepG-2、人肺腺癌细胞A549和人白血病细胞HL-60的细胞毒活性。
结果:对菌株产物的HPLC分析结果表明使用两种不同方法发酵的菌株次级代谢产物具有一定的差异性,新方法发酵产物的丰富度要高于原方法。从270L新方法发酵液中分离得到5个已知化合物(编号HP1~HP5),分别鉴定为:5-hydroxy-5-isopropenyl-4-methoxy-2(5H)-furanone、5-hydroxy-5-isopropyl-4-methoxy-2(5H)-furanone、 methyl2,4-dihydroxy-3,5,6-trimethylbenzoate、dehydroaustinol、dehydroaustin。活性测试结果表明HP1对HeLa、HepG-2、A549、HL-60细胞具有一定程度的细胞毒活性,IC50值分别为41.092μmol/L、27.862μmol/L、38.411μmol/L、25.934μmol/L;HP4和HP5对各细胞的IC50值均大于100μmol/L,HP4和HP5对以上四株细胞无明显的细胞毒活性。
结论:发酵方式对菌株L10Q37的次级代谢产物有很大影响,先摇动后静置的发酵方法有助于刺激L10Q37产生不同的化合物,增加代谢产物的化学多样性。OSMAC策略简便实用,是挖掘微生物代谢潜力的良好方法,本次实验的运用对蛇足石杉内生真菌及其他微生物的次级代谢产物研究具有一定的参考价值及指导意义。