肝脏是氨基酸和胆汁酸代谢的主要脏器，生理状态下两者在血清中浓度维持在一定水平。氨基酸、胆汁酸的合成和排泄过程，经过肝脏的生物化学和生物物理两大屏障，且机体内整个氨基酸和胆汁酸代谢谱与肝胆系统密切相关，肝脏损伤后肝内代谢酶的活性发生变化或胆管受损可引起这两类物质代谢异常。因此，氨基酸和胆汁酸代谢网络变化分析能反映肝细胞合成，摄取及分泌功能，基于这两类内源性代谢物的分析对肝损伤评价及机制探讨、防治药物的筛选和评价以及临床肝病的诊断等具有重要的意义。
本论文以血清氨基酸和胆汁酸为标识物，利用代谢轮廓分析方法，通过比较不同类型药源性肝损伤血清氨基酸和胆汁酸代谢的变化，辨识与肝损伤相关的氨基酸和胆汁酸类靶标，如苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、牛磺氨酸结合型胆汁酸等，首次从氨基酸和胆汁酸代谢水平评价不同类型的药源性肝损伤及茵陈、栀子和大黄肝脏保护作用并探讨其可能的机制。主要研究内容和结果如下：
1.建立了基于HILIC-MS/MS(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)分析技术的血清中氨基酸定量分析方法，包括：(1)血清中15个编码型氨基酸的定量分析方法；(2)血清中Phe和Met代谢通路上相关非编码型氨基酸定量分析方法；(3)血清中1-13C标记的甲硫氨酸定量分析方法。所建立的分析方法LOQ(limit of quantification, LOQ)达到0.05μg·mL-1，比文献方法提高了150倍左右，线性范围为0.05μg·mL-1-10μg·mL-1，适用于生物样本的高通量、微量或痕量检测分析.
应用本课题组建立的胆汁酸代谢轮廓分析方法，对牛磺氨酸结合型胆汁酸、甘氨酸结合型胆汁酸和游离型胆汁酸共17种内源性胆汁酸进行了定量分析。
应用本文所建立的氨基酸、本课题组建立的胆汁酸代谢轮廓分析，对药源性肝损伤及茵陈、栀子和大黄的肝脏保护作用及其机理进行了评价。
2.建立了对乙酰氨基酚(APAP)、氯丙嗪(CH)和α-异硫氰酸萘酯(ANIT)造成的急性肝损伤大鼠模型，采用血清生化指标检测、病理组织切片检查、氨基酸和胆汁酸代谢轮廓分析结合化学计量学(主成分分析，PCA:偏最小二乘法-判别分析，PLS-DA)方法分别对模型进行了肝损伤评价。肝脏损伤后谷丙转氨酶(alanine aminotransaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性和总胆红素(total bilirubin, TBIL)含量都显著性升高，其中APAP损伤后ALT和AST升高最明显，ANIT损伤后TBIL升高最为显著。病理组织切片检查结果表明APAP损伤以肝细胞大块坏死为主，CH损伤后肝细胞出现疏松和脂肪变性，ANIT损伤后可见肝内胆管胆汁淤积.氨基酸代谢轮廓谱分析结果显示Phe在所有模型中都是显著性升高，精氨酸(Arg)明显下降。化学计量分析结果表明Phe和Arg可以表征APAP、CH和ANIT的毒性，而且可区分不同肝损伤模型的损伤类型。胆汁酸代谢轮廓分析表明牛磺氨酸结合型胆汁酸在APAP和ANIT模型中是显著性升高，甘氨酸结合型胆汁酸在APAP和CH模型中显著性下降，游离型胆汁酸在CH模型中是升高而在ANIT中则下降。化学计量分析结果表明牛磺氨酸结合型胆汁酸可以表征APAP和ANIT的毒性。
不同毒性剂量CH诱导大鼠急性肝损伤后，血清生化指标检测和病理组织切片检查显示肝脏损伤程度随着剂量增大而增强。氨基酸代谢轮廓分析结果显示不同剂量组氯丙嗪和对照组大鼠体内源性氨基酸分析的散点图呈一定的轨迹分布，Phe随着毒性剂量增加而升高，Arg、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和谷氨酰胺(Gln)是下降的，上述氨基酸均呈剂量依赖性，可作为表征CH毒性剂量差异的氨基酸标识物。胆汁酸代谢轮廓分析表明甘氨酸结合型鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨酸结合型去氧胆酸(GDCA)和石胆酸(LCA)随着毒性剂量增加而显著性下降，为表征CH毒性剂量差异的胆汁酸类标识物。
黄药子和黄独素B诱导大鼠肝脏损伤后，黄药子损伤组的血清生化指标变化比黄独素B组明显，病理组织切片观察显示黄药子组的肝脏损伤程度较严重，而黄独素B组未显示出明显毒性。氨基酸代谢轮廓谱分析表明，黄药子造成损伤后Arg显著性下降，Phe、Trp、缬氨酸(Val)、Met、胱硫醚(Cysta)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、Gln和丝氨酸(Ser)升高显著。化学计量分析结果显示黄药子损伤组与正常组分离趋势明显，结合各种氨基酸对样品分类的贡献度(VIP值)，Gln、Arg、Tyr和Cysta可能为表征黄药子和黄独素B毒性的氨基酸标识物。胆汁酸代谢轮廓分析后显示黄药子损伤组中有11种胆汁酸都升高显著，黄药子组和正常组相互分离，牛磺氨酸结合型胆酸(TCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、牛磺氨酸结合型猪去氧胆酸(THDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、甘氨酸结合型胆酸(GCA)、牛磺氨酸结合型熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺氨酸结合型鹅去氧胆酸(TCDCA)和胆酸(CA)可能为表征黄药子和黄独素B毒性的胆汁酸标识物。通过PCA和PLS-DA方法综合比较分析黄药子所致肝损伤及各种药源性肝损伤模型，黄药子损伤类型与APAP、CH和ANIT的损伤模型相比较得知其损伤机理可能与APAP类似，而且Arg、Phe和Pro能进一步评价区分APAP、CH、ANIT和黄药子造成的不同损伤类型。
3.应用血清生化检测、病理组织切片观察、氨基酸和胆汁酸代谢轮廓和化学计量学分析方法分别评价茵陈、栀子和大黄以及阳性对照药熊去氧胆酸(UDCA)对CH和ANIT造成的2种急性肝损伤模型的保护作用并探讨其可能的保护机制。茵陈、栀子和UDCA均能使CH诱导的ALT和AST活性升高向正常状态恢复的趋势，病理组织切片检查显示栀子具有显著的肝脏保护作用，茵陈和UDCA保护作用较弱。茵陈和栀子保护组均可使CH诱导的Trp、Met和Pro下降以及亮氨酸/异亮氨酸(Leu／Ⅱe)、胱氨酸(Cys2)和牛磺酸(Tau)升高向正常氨基酸水平恢复，结合化学计量分析结果表明Trp、Met、Leu/Ile和Tau能够表征栀子和茵陈的保护效应。UDCA的氨基酸代谢轮廓分析未显示保护作用。栀子和茵陈保护CH致肝损伤组的胆汁酸代谢轮廓分析结果表明TCA和TCDCA有恢复正常趋势。
对ANIT致急性肝损伤的保护作用中，栀子和大黄均能使ANIT诱导ALT和AST活性升高向正常水平恢复的趋势，病理组织切片检查显示栀子和茵陈均具有明显的肝脏保护作用。氨基酸代谢轮廓分析显示茵陈和栀子保护组与正常组相离较近，并有远离ANIT损伤组趋势，大黄组的氨基酸轮廓与其它各组不一致。胆汁酸代谢轮廓结合化学计量学分析后显示茵陈和栀子能使ANIT诱导甘氨酸结合型和游离型胆汁酸降低向正常水平恢复，且栀子的恢复作用强于茵陈；大黄能使ANIT诱导牛磺氨酸结合型胆汁酸升高向正常水平恢复，表明大黄不同的作用机制。
4.研究了86例健康人、170例肾病和32例肝病病人体内的氨基酸代谢轮廓差异，表明可以从氨基酸代谢轮廓将上述样本进行分型，发掘了与肝病相关的氨基酸标识物(Arg、Phe和Pro)，该结果与动物实验结果相符，为临床肾病和肝病的诊断奠定了基础；分析了56例健康人和99例肝病病人体内胆汁酸的代谢轮廓差异，结果表明采用OPLS-DA分析方法能将正常人和肝病病人样本进行很好分型，具有一定临床诊断价值。
本课题在建立氨基酸和胆汁酸代谢轮廓谱分析方法的基础上，应用代谢组学研究思路并结合临床生化指标、肝脏病理组织等评价及探讨不同类型药源性肝损伤及中药防治作用的异同，对其它中药毒性与安全性评价、药源性肝损伤提供了新的研究思路和方法，也为肝胆疾病的诊疗以及利胆药物筛选等奠定了基础。
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