扶正化瘀方影响肝细胞凋亡的抗肝纤维化作用机制与部分有效成分  学位论文  

目的:探讨扶正化瘀方影响肝细胞凋亡的抗肝纤维化作用机制;建立高内涵筛选评价中药成分细胞毒性与细胞凋亡方法,并初步发现扶正化瘀方抑制肝细胞凋亡部分有效成分;进一步研究该方部分有效成分抗肝细胞凋亡的作用机制。
　　 方法：本论文分为四个部分。
　　 1.CCl4皮下注射诱导肝纤维化小鼠模型,设18h、4w和8w3个观察时间点。每个时间点小鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方组和N-乙酰半胱氨酸组。用药组于造模前3天开始预防给药,直至各时间点结束。试剂盒检测血清ALT、AST、Alb和T.Bil水平;HE和天狼星红染色观察肝组织炎症病理及胶原沉积;TUNEL法检测细胞凋亡;盐酸水解法检测肝组织羟脯氨酸含量。
　　 2.肝脏原位灌流分离小鼠原代肝细胞和大鼠原代肝星状细胞(HSC)。放线菌素D(Act D)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肝细胞凋亡模型。原代肝细胞分为正常对照组、凋亡模型组、扶正化瘀方组和细胞凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)组。模型和用药组于造模前1h分别加入10％正常大鼠血清、10％扶正化瘀方药物血清、10％正常大鼠血清+50μMZ-VAD-FMK。试剂盒抽提各组肝细胞DNA,与分离培养的原代肝星状细胞共孵育24h。倒置显微镜观察原代肝细胞和HSC形态;DNA凝胶电泳检测肝细胞凋亡;免疫荧光和Westernblot法检测HSC标志物α-SMA表达,Westemblot法检测Ⅰ型胶原表达。
　　 3.“多指标细胞毒性试剂盒”染色,高内涵筛选分析检测药物成分对HL-7702细胞的毒性影响。建立Act D/TNF-α诱导正常人肝细胞系HL-7702的细胞凋亡模型。HL-7702细胞分为正常对照组、凋亡模型组和扶正化瘀方单味药成分组。细胞于造模前1h添加药物成分预处理。“多指标细胞凋亡”试剂盒染色,高内涵筛选分析检测药物对细胞凋亡的影响。
　　 4.脂多糖(LPS)联合D-氨基半乳糖胺(GalN)诱导小鼠急性肝损伤模型。丹酚酸B(Sal B)组于造模前3天开始预防给药。试剂盒检测血清ALT、AST水平和肝组织SOD、MDA含量;HE染色观察肝组织炎症病理;TUNEL法检测细胞凋亡。Act D/TNF-α诱导HL-7702细胞凋亡模型。细胞于造模前1h添加SalB预处理。流式细胞术和DNA凝胶电泳检测细胞凋亡;免疫荧光和Westernblot法检测TNF-R1表达;Westernblot法检测Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3和cleaved Caspase-3的表达。
　　 结果：
　　 1.与正常组小鼠相比,CCl4造模18h的模型小鼠血清ALT、AST显著升高,肝组织结构破坏严重,肝窦出血,大量肝细胞变性、坏死,凋亡肝细胞数量显著增加,未见胶原纤维增生;与模型组相比,扶正化瘀方对血清ALT、AST无明显影响,但对肝细胞变性、坏死和肝窦出血病变有一定改善,对肝细胞凋亡有显著抑制作用。CCl4造模4周时,模型组小鼠血清ALT、AST保持在较高水平,肝细胞变性、坏死和肝组织炎症病变较为明显,而细胞凋亡鲜见,胶原纤维明显增生,肝组织羟脯氨酸含量升高;扶正化瘀方可明显降低血清AST,改善肝细胞变性、坏死和肝组织炎症,对细胞凋亡无明显影响,可减少胶原纤维生成,有一定降低羟脯氨酸含量作用,但无统计学差异。CCl4造模8周时,模型组小鼠血清ALT、AST仍保持在较高水平,肝细胞变性、坏死和肝组织炎症病变仍较为明显,细胞凋亡依然鲜见,肝组织胶原纤维沉积增加,羟脯氨酸含量明显升高;扶正化瘀方可明显降低血清ALT、AST,改善肝细胞变性、坏死和肝组织炎症,增加肝组织细胞凋亡,减少胶原纤维生成,降低羟脯氨酸含量。相关分析显示,扶正化瘀方降低羟脯氨酸的作用与其早期抗肝细胞凋亡作用呈显著正相关。
　　 2.与正常肝细胞DNA刺激的原代肝星状细胞相比,Act D/TNF-α诱导的肝细胞凋亡DNA可剂量依赖性的刺激肝星状细胞表达α-SMA。与正常肝细胞DNA相比,凋亡模型组肝细胞DNA出现典型的“DNA ladder”即片段化改变,扶正化瘀方可明显减轻凋亡DNA片段化。正常肝细胞DNA刺激组的肝星状细胞表达一定量的α-SMA和Ⅰ型胶原,凋亡肝细胞DNA刺激组的肝星状细胞α-SMA和Ⅰ型胶原表达显著增加,扶正化瘀方肝细胞DNA组的肝星状细胞α-SMA和Ⅰ型胶原表达明显减少。
　　 3.药物高内涵筛选方法(HCS)从细胞核大小、细胞膜通透性和溶酶体物质3个方面检测Sal B对HL-7702细胞的毒性影响,alamarBlue法检测结果与其一致,二者均发现,10-6M和10-5M的Sal B对细胞无毒性作用,10-4和10-3M有明显细胞毒性作用。HCS和DNA凝胶电泳法检测Act D/TNF-α诱导的HL-7702细胞凋亡,均能区别出正常细胞和凋亡细胞,两种方法的检测结果具有较好的一致性。应用HCS对扶正化瘀方单味药--丹参、桃仁、虫草菌丝和五味子的15种化学成分进行细胞毒性分析,以无细胞毒性作用的浓度进行抗凋亡筛选实验。HCS检测发现,丹酚酸A、丹酚酸B、五味子乙素能有效防止TNF-α诱导的HL-7702细胞凋亡,表现为防止细胞核减小,减少异常线粒体物质增加;丹参酮ⅡA和五味子酯甲有促进HL-7702细胞凋亡作用。其它化学成分无明显作用。
　　 4.与正常组小鼠相比,LPS/GalN作用组小鼠血清ALT、AST显著升高,肝组织SOD活性降低,MDA含量升高,肝细胞出现变性、坏死,炎症细胞浸润明显,大量肝细胞发生凋亡;Sal B可降低血清ALT、AST水平,改善肝组织过氧化损伤指标SOD、MDA,减轻肝细胞变性、坏死和肝组织炎症细胞浸润,减少肝细胞凋亡。与正常对照细胞相比,Act D/TNF-α诱导的HL-7702细胞明显发生凋亡,Sal B有显著抑制其凋亡作用。与正常对照细胞相比,凋亡HL-7702细胞TNF-R1表达显著升高,线粒体调控因子Bcl-2、Bax表达比例失衡,细胞色素C从线粒体向细胞质中释放增加,Caspase-3向cleaved Caspase-3转化增加;Sal B可降低凋亡HL-7702细胞TNF-R1表达,纠正Bcl-2、Bax表达比例失衡,减少细胞色素C从线粒体向细胞质中释放及Caspase-3向cleaved Caspase-3的转化。
　　 结论：
　　 1.扶正化瘀方有显著抑制CCl4小鼠模型早期肝细胞凋亡和后期肝组织胶原纤维沉积作用,两者有显著相关性,抗肝细胞凋亡是该方抗肝纤维化作用机制之一。
　　 2.Act D/TNF-α诱导的肝细胞凋亡DNA有刺激肝星状细胞活化作用,扶正化瘀方可以减少Act D/TNF-α诱导的肝细胞凋亡DNA生成,进而间接抑制肝星状细胞活化。
　　 3.高内涵筛选分析是评价中药成分细胞毒性和细胞凋亡的高效可靠方法;扶正化瘀方成分丹酚酸A、丹酚酸B、五味子乙素有抑制Act D/TNF-α诱导的HL-7702肝细胞凋亡作用,丹参酮ⅡA、五味子酯甲有促进肝细胞凋亡作用。
　　 4.丹酚酸B有显著的抑制肝细胞凋亡作用,其抑制肝细胞凋亡的作用机制与细胞凋亡死亡受体与线粒体通路有关。