吡咯里西定生物碱(pyrrolizidine alkaloids,Pas)是以双稠吡咯环为母核的一大类化合物家族。部分Pas由于具有1,2位不饱和结构,会遭受P450酶的代谢活化催化而造成肝毒性、肺毒性等。该类化合物广泛的存在于菊科、紫草科、豆科等植物中,而这些植物被广泛的用于食品、茶制品、牧草原料等,引起了世界范围内的关注。同时,部分中药中也含有此类化合物,因此,Pas所致毒性对中药的国际化进程也产生了严重的负面影响。故有必要对其代谢及毒性机制进行深入研究。
Pas诱导的毒性与代谢过程密切相关,因此,Pas的代谢及其机制研究对其毒性机制研究尤为重要。Pas的各代谢机制下的代谢稳定性会因其不同的结构有所差异,并进一步对毒性产生影响,因此阐明结构-代谢-毒性间的关系将非常重要。代谢活化是导致Pas致毒的根本原因,研究代谢活化对Pas代谢稳定性的影响将直接有助于对某些Pas毒性现象的阐释。同时,除了P450酶催化的代谢活化之外,Pas还具有其他的一些代谢途径可能抑制或者阻断代谢活化的过程,进而影响Pas所致毒性。Ⅰ相代谢酶中,酯酶在这方面的作用最为明显,然而对于Ⅱ相代谢酶,相关的Pas代谢机制研究仍为空白。而系统的进行Pas的Ⅱ相代谢机制研究不仅有助于加强对Pas代谢网络的认识,更有助于研究Pas在各种代谢机制影响下的代谢稳定性与毒性的相互关系。另一方面,Pas在不同代谢机制下的代谢稳定性的相对强弱,除了取决于Pas自身的结构之外,还取决于人与动物及动物与动物之间的代谢酶系统的差异。综合分析不同种属的各代谢机制下Pas的相对代谢稳定性,将有助于从代谢机制上阐释不同种属对Pas的毒性表现差异。
鉴于上述原因,本文系统的开展了Pas的Ⅰ相及Ⅱ相代谢机制研究。并通过对它们代谢机制的考察,结合毒性数据,揭示了结构与代谢、代谢与毒性间的变化规律。主要的结果和结论如下:
1.相对而言,senecionine的代谢活化效率要远远高于adonifoline,以Clint值衡量,前者(2.53μL/min/mg protein)约为后者(0.15μL/min/mg protein)的16.9倍,从根本上解释了adonifoline在毒性弱于senecionine的原因。
2.对于乙酰化的Pas,会在酯酶催化下发生乙酯键的水解,生成脱乙酰化的产物。通过isoline和clivorine的代谢机制研究,证明这是它们在人肝微粒体中的主要的代谢途径。以200μM浓度下的代谢速率进行衡量,isoline的代谢活化活性位于所有代谢途径的第二位,但仍然仅有占第一位的脱乙酰化活性的12％左右,clivorine的代谢活化活性是其脱乙酰活性的55％左右。文献报道,酯酶抑制剂可以增强isoline在小鼠体内的毒性,而雄性大鼠由于酯酶活性低于雌性大鼠也更加容易遭受clivorine的毒性攻击。而关于乙酰化Pas的脱乙酰化代谢机制的研究对乙酰化Pas的结构-毒性间的关系进行了合理的阐释。
3.通过位点阻断,senecionine的葡萄糖醛酸化代谢位点鉴定为碱基部分叔胺基团的氮原予,该结果同时被化学合成的senecionine N-glucuronide对照品所证实。进一步的实验证实Adonifoline,monocrotaline,isoline,clivorine在人肝中同样遭受N-位葡萄糖醛酸化的代谢。根据Pas葡萄糖醛酸化的位点鉴定结果,可以推测,N-葡萄糖醛酸化可能是大部分Pas的一条共有的代谢途径。
4.关于senecionine的N-葡萄糖醛酸化的代谢动力学研究给出其Clint值为3.88μL/min/mgprotein,与senecionine的代谢活化(2.53μL/min/mg protein)相比,是其约1.5倍。证明其效率高于代谢活化,是senecionine代谢网络中最为显著的代谢途径。其与毒性的相关性值得深入研究。进一步的,原代人肝细胞的细胞毒性实验表明,senecionine在50-1000μM的浓度范围内对正常的原代人肝细胞基本不表现出毒性。而当选择性抑制剂hecogenin(1,10μM)对原代人肝细胞的UGT1A4进行抑制后,senecionine对其毒性显著增大,细胞活力被抑制50％以上;表明senecionine的葡萄糖醛酸化在原代人肝细胞内可以显著的与代谢活化发生竞争,是人体抵御senecionine代谢活化致毒的重要防御机制。
5.兔体内动力学实验表明,senecionine在兔体内的主要代谢产物为senecionine N-glucuronde。该产物的体内暴露量是其原型及其他代谢产物总和的两倍之多。文献报道兔是对Pas毒性的高耐受性种属,但是通过水解和氮氧化途径都难以对此加以解释。本研究的结果证明,高的N-葡萄糖醛酸化活性是兔抵御Pas代谢活化致毒的重要防御机制。
6.通过senecionine的代谢的种属差异研究,本文将各代谢机制下的senecionine的代谢稳定性与其对不同种属的肝毒性强弱进行了良好的相关。通过拮抗系数的构建(葡萄糖醛酸化效率与代谢活化效率的比值,或者水解效率与代谢活化效率的比值),合理的反映了不同动物种属对senecionine不同毒性反应的机制。大鼠、小鼠、犬等种属具有高代谢活化活性而缺乏与之相竞争的代谢途径,因此对Pas所致肝毒性具有高敏感性。兔尽管具有一定程度的催化senecionine的代谢活化活性的能力,但是由于其具有更高的葡萄糖醛酸化活性与代谢活化相竞争(前者Clint值约为后者的6.65倍),使其免于遭受Pas的肝毒性攻击。而在豚鼠体内,担负这种拮抗代谢活化使命的代谢途径则是对senecionine的大环内酯键的水解代谢(其Clint值约为代谢活化的180倍)。
7.通过本文分析,影响Pas对人及动物毒性的因素主要包含如下几个方面,第一是Pas自身的结构,自身结构如果易于遭受代谢活化的攻击,则容易产生肝毒性,如第1点中所述。第二是体内催化Pas代谢的各种途径的相对活性的强弱,与代谢活化相竞争的高效率的代谢途径将影响到不同动物种属以及不同性别对Pas毒性反应,例如senecionine的代谢种属差异与毒性种属差异的相关性。
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