当归补血汤及其组分配伍影响肝血管新生的抗肝纤维化作用评价及机制研究  学位论文  

目的:在前期当归补血汤抗肝纤维化抑制血管新生取效的基础上，针对肝纤维化血管新生病理，通过拆方研究，阐明该方抗肝纤维化的配伍特点;进一步筛选活性成分及体外毒、效范围;通过星点设计进行活性成分组分配伍组方，并进行体内外验证。
　　方法:本论文分为四个部分。
　　1、当归补血汤及其拆方影响肝脏血管新生的抗肝纤维体内研究。雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、索拉非尼组、当归补血汤组、黄芪组、当归组。CCl4复合高脂低蛋白饮食诱导大鼠肝纤维化模型。自造模第2周开始给药，每天1次，共4周。实验结束观察大鼠一般情况，包括生存率、体重、肝体比、脾体比变化;检测血清肝功能包括ALT、AST、Alb水平;HE及天狼猩红染色观察肝组织炎症及胶原沉积，肝组织羟脯氨酸含量、肝组织Ⅰ型胶原和α-SMA表达观察肝纤维化情况;同步辐射二维成像、扫描电镜观察肝窦窗孔、免疫荧光及蛋白印迹法检测肝组织CD31、vWF、VEGF、VEGFR2、ERK、p-ERK蛋白表达以评价肝脏血管。
　　2、当归补血汤抗肝纤维化活性成分筛选。CCK8法筛选当归补血汤9种药物成分作用于SK-HEP-1、LX-2、HL-7702细胞株的最大无毒浓度;TGF-β1诱导LX-2构建星状细胞活化模型，ECGs诱导SK-HEP-1构建内皮细胞增殖模型，H2O2诱导HL-7702构建肝细胞损伤模型，分为空白对照组、模型组、当归补血汤成分组、阳性药物组，无血清培养液饥饿24 h后，各药物成分与诱导药物同时孵育48 h。CCK8法检测药物对细胞毒性及增殖影响，根据剂量反应函数拟合曲线计算药物成分的IC50。
　　3、当归补血汤组分配伍抗肝纤维化活性评价。细胞水平:根据第二部分结果并结合课题组前期与血管新生相关结果，筛选出黄芪皂苷Ⅰ、毛蕊异黄酮、欧当归内酯A进行组分配伍，分为空白对照组、模型组、组分配伍组、阳性药物组，细胞模型及处理方法同第二部分。CCK8法分析细胞增殖及毒性，星点设计效应面法分析3成分之间最佳配伍的浓度，Chou-Talalay联合指数法分析3成分之间的协同作用。高内涵检测LX-2中α-SMA表达。转基因斑马鱼血管新生模型评价组分配伍抑制血管的作用。
　　4、当归补血汤组分配伍抗肝纤维的体内验证。C57/BLC小鼠随机分为正常组、正常加配伍高剂量组、模型组、索拉菲尼组、欧当归内酯A组、配伍高剂量组、配伍低剂量组，采用DMN诱导肝纤维化模型，每周3次，共4周。自造模第2周开始，各药物干预组腹腔注射相应药物，每天1次，共2周。造模结束，检测血清ALT、AST、Alb水平;HE、天狼猩红染色及肝组织Hyp含量观察肝脏炎症及纤维化改变。
　　结果:
　　1、当归补血汤及其拆方影响肝脏血管新生的抗肝纤维体内研究结果:相比正常组，模型组大鼠体重减轻，肝体比、脾体比增加;血清ALT、AST水平升高，Alb降低;肝组织脂肪变性及胶原沉积明显，Hyp含量升高，col-Ⅰ、α-SMA表达增加;肝窦内皮窗孔闭合，肝脏微血管纹理增多，肝组织vWF及CD31表达增加;肝组织MDA含量增加，SOD活性降低，NO增多，NOS活性升高;肝组织VEGF、VEGFR2、p-ERK表达增加，ERK表达未见变化。相比模型组，各治疗组大鼠体重、肝体比无显著改变，脾体比明显降低;Alb显著提高、AST显著降低;当归补血汤及黄芪组ALT显著降低;各用药组炎症及胶原沉积有不同程度的改善;肝组织Hyp含量显著降低，col-Ⅰ、α-SMA表达有不同程度的下降;窗孔数量增加，血管纹理有不同程度减少，vWF及CD31表达下降;SOD活性显著升高，NOS显著升高，黄芪组MDA显著降低，全方组及黄芪组NO显著降低;各用药组VEGF、VEGF-R2、p-ERK表达有不同程度的减少。
　　2、当归补血汤活性成分筛选结果:当归补血汤各成分对LX-2星状细胞毒性显示，毛蕊异黄酮及欧当归内酯A分别在100/μmol/L、10μmol/L浓度出现毒性，其余成分未见明显毒性;药效学显示，黄芪皂苷Ⅰ、毛蕊异黄酮、欧当归内酯A组具有抑制星状细胞活化作用，其IC50分别为269.05、137.92、6.62μmol/L，其他成分对LX-2细胞活化无明显抑制作用。在SK-HEP-1内皮细胞上的毒性显示，欧当归内酯A对正常的内皮细胞有一定毒性，IC50为13.69μmol/L，其余成分未见明显毒性;药效学显示，欧当归内酯A、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、毛蕊异黄酮具有抑制内皮细胞增殖的作用，其IC50分别为28.59、128.29、110.51、777.24μmol/L，其他成分未见明显抑制作用。各成分在HL-7702肝细胞上的毒性检测显示，欧当归内酯A、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、黄芪皂苷Ⅰ具有一定毒性，其IC50分别为1.22μmol/L、216.49μmol/L、435.15μmol/L、532.40μmol/L，其余药物未见明显毒性;药效学显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷及黄芪皂苷Ⅱ低浓度时对H2O2损伤的HL-7702肝细胞具有保护作用，其余成分对HL-7702肝细胞H2O2损伤无保护作用。
　　3、当归补血汤组分配伍抗肝纤维化体外评价:星点设计结果显示，在LX-2星状细胞活化模型上黄芪皂苷Ⅰ52-199μmol/L、毛蕊异黄酮76-146μmol/L、欧当归内酯A20-32μmol/L的浓度范围内具有最佳联用作用;Chou-Talalay联合指数法分析显示黄芪皂苷Ⅰ、欧当归内酯A、毛蕊异黄酮三者按照10∶3∶9进行配伍后，随浓度增加，联用抑制低LX-2活化效果增强，可降低LX-2中α-SMA的表达，抑制SK-HEP-1内皮细胞增殖，并在低浓度开始发挥联用作用，对HL-7702肝细胞H2O2损伤模型未见明显保护作用，但对正常HL-7702肝细胞有减毒作用;转基因斑马鱼结果显示:三者配伍组合后在浓度为70.4μmol/L时可以减少斑马鱼胚胎功能血管数量，降低斑马鱼血管生成活性
　　4、当归补血汤组分配伍抗肝纤维的体内验证结果:与正常组相比，模型组血清ALT水平明显升高，白蛋白明显降低，胶原沉积明显，肝组织羟脯氨酸含量明显增加;与模型组相比，各用药组血清ALT水平有不同程度的降低，胶原沉积有不同程度的减轻，肝组织Hyp含量显著降低。
　　结论:
　　1、当归补血汤及其拆方具有抗肝纤维化作用，其中黄芪益气，重在改善肝脏炎症、抗脂质过氧化及NO释放，当归养血活血，重在改善星状细胞活化，增加肝窦内皮细胞窗孔数量及改善肝窦毛细血管化，二者配伍，通过保护肝窦内皮细胞损伤发挥抗肝纤维化作用。
　　2、欧当归内酯A、毛蕊异黄酮、黄芪皂苷Ⅰ三种成分可能是当归补血汤抗肝纤维化的主要活性成分，初步明确了三种成分在星状细胞、内皮细胞和肝细胞上的毒、效剂量（详见结果部分）。
　　3、黄芪皂苷Ⅰ、欧当归内酯A、毛蕊异黄酮按照10∶3∶9浓度组合后形成的组分配伍在体外具有抑制肝星状细胞活化、抑制内皮细胞增殖及抑制斑马鱼血管新生作用，在体内具有抗DMN诱导小鼠肝纤维化和保护肝脏炎性损伤的作用。