目的：
基于实验室前期对益母草抗大鼠梗死性心室重构的研究背景，本实验利用原代培养的乳鼠心肌细胞，观察益母草有效成分水苏碱对心肌细胞肥大的影响，重点关注水苏碱对肥大心肌细胞内氧化信号通路的调控。本论文包括三个部分：（一）心肌细胞肥大模型的建立与评价；（二）益母草水苏碱对心肌细胞肥大的药效学研究；（三）益母草水苏碱对抗心肌细胞肥大的效应机制研究。期望通过本实验，为将益母草这种传统中药应用于心室重构治疗领域提供一定的实验依据。
方法：
（一）心肌细胞肥大模型的建立与评价
原代培养乳鼠心肌细胞，利用不同浓度（10-8～10-6M）的血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）分别刺激心肌细胞24h、48h和72h，通过对细胞活力、细胞表面积以及细胞蛋白/DNA比值等指标评价心肌细胞肥大模型的建立，为后续的药效学实验奠定基础。
（二）益母草水苏碱对心肌细胞肥大的药效学研究
利用不同浓度的益母草水苏碱(10-7～10-4M)，观察其能否对抗AngⅡ导致的心肌细胞肥大反应。通过对细胞活力、细胞表面积、蛋白/DNA比值以及培养上清中BNP含量等指标评价益母草水苏碱的抗心肌细胞肥大效应。
（三）益母草水苏碱对抗心肌细胞肥大的效应机制研究
在明确益母草水苏碱药效的基础上，①用H2DCFH-DA荧光标记、流式细胞仪检测细胞内ROS含量；②NBT法测定NAD(P)H氧化酶活性；③Western Blot测定胞浆内氧敏感型激酶ASK-1、胞浆以及核内NF-κB(p65)、NF-κB抑制蛋白IκBα和磷酸化的IκBα(ser32)蛋白水平的改变；④利用TransAMTM NF-kB p65 Transcription Factory Assay Kit测定NF-κB核内DNA结合转录活性；⑤Elisa测定细胞上清中TNFα含量，同时利用NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI以及抗氧化剂NAC等，探讨益母草水苏碱对肥大心肌细胞内氧化信号的调节。
结果：
（一）心肌细胞肥大模型的建立与评价
10-7M和10-6M浓度的AngⅡ处理能增加心肌细胞体表面积，尽管10-8～10-6M浓度的AngⅡ作用48小时后均可显著提高细胞内蛋白含量(P＜0.05)，但仅10-6M浓度的AngⅡ处理可提高心肌细胞蛋白/DNA比值(P＜0.05)，且其处理心肌细胞48h时并不会明显影响心肌细胞活力(P＞0.05)。基于蛋白/DNA比值是反应单个细胞蛋白含量、判断心肌细胞肥大的客观指标，因此选择10-6M浓度的AngⅡ刺激心肌细胞48h来建立心肌细胞肥大模型，进行后续的药效学实验。
（二）益母草水苏碱对心肌细胞肥大的药效学研究
通过检测细胞活力，发现10-7～10-4M浓度的益母草水苏碱对肥大心肌细胞活力无明显影响(P＞0.05)；通过对细胞体表面积及蛋白/DNA比值等指标的检测，发现益母草水苏碱干预对心肌细胞DNA含量无显著改变(P＞0.05)，但可以降低肥大心肌细胞表面积及蛋白/DNA比值(P＜0.05)，且呈一定剂量依赖趋势；通过测定细胞培养上清液中的BNP含量，发现益母草水苏碱干预可显著缓解AngⅡ致BNP增多的现象(P＜0.05)。以上结果提示一定浓度的益母草水苏碱可对抗AngⅡ的致细胞肥大效应。
（三）益母草水苏碱对抗心肌细胞肥大的效应机制研究
1.益母草水苏碱对心肌细胞ROS的影响：
AngⅡ处理24h导致心肌细胞内ROS阳性细胞比例较正常组明显增高(P＜0.01)：10-6～10-4M的益母草水苏碱以及10-6M络沙坦均能缓解以上现象（P＜0.05）；10-7M浓度的益母草水苏碱组和AngⅡ组相比无显著性差异(P＞0.05)。
2.益母草水苏碱对心肌细胞内NAD(P)H氧化酶活性的影响：
在模型水平上给予益母草水苏碱、络沙坦、DPI及NAC干预可显著降低NAD(P)H氧化酶活性(P＜0.05)。
3.益母草水苏碱对心肌细胞浆内ASK蛋白表达的影响
AngⅡ处理24h使心肌细胞浆内ASK蛋白表达明显增多(P＜0.01)；单纯给予益母草水苏碱处理、以及在模型水平上给予益母草水苏碱、络沙坦、DPI及NAC干预均显著降低ASK蛋白表达水平(P＜0.05)。
4.益母草水苏碱对心肌细胞浆内IκBα蛋白、磷酸化p-IκBα蛋白(ser32)的影响
4.1各组细胞浆内总IκBα蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。
4.2 AngⅡ处理使心肌细胞浆内p-1κBα(ser32)蛋白表达增多(P＜0.05)；与AngⅡ组相比较，单纯给予益母草水苏碱处理、以及在模型水平上给予益母草水苏碱、络沙坦、DPI及NAC干预可显著降低胞浆内磷酸化p-IκBα(ser32)蛋白水平(P＜0.05)。
5.益母草水苏碱对心肌细胞浆以及核内NF-κB(p65)表达的影响
5.1各组细胞浆内NF-κB(p65)蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。
5.2 AngⅡ处理使核内NF-κB(p65)蛋白表达增高(P＜0.05)；与AngⅡ组相比较，单纯给予益母草水苏碱处理、以及在模型水平上给予益母草水苏碱、络沙坦、DPI及NAC干预可显著降低核内NF-κB(p65)蛋白水平(P＜0.05)。
6.益母草水苏碱对NF-kB(p65)核内DNA结合转录活性的影响。
与AngⅡ组相比较，NAC处理能明显降低核内p65的转录活性(P＜0.05)；其余干预组的p65转录活性与AngⅡ组未达显著性差异(P＞0.05)。
7.益母草水苏碱对细胞培养上清中TNF-α含量的影响
与正常对照组相比较，AngⅡ组TNF-α含量显著增高(P＜0.05)；单纯给予益母草水苏碱或在模型水平上给予益母草水苏碱或络沙坦干预能降低TNF-α含量(P＜0.05)。
结论：
1.10-6M浓度的AngⅡ刺激心肌细胞48h可成功建立心肌细胞肥大模型。
2.益母草水苏碱可对抗AngⅡ的致心肌细胞肥大效应，且呈一定剂量依赖趋势。
3.益母草水苏碱干预可降低NAD(P)H氧化酶活性、减少细胞内ROS生成、抑制胞浆内ASK-1蛋白和磷酸化p-IκBα蛋白表达、阻止NF-κB入核、同时降低胞内TNF-α含量，通过对以上氧化信号的调节有效抑制心肌细胞肥大。
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