基于TGF-β/Smads信号通路从中医肾主耳角度探讨耳聋左慈丸对肾脏和内耳损伤的保护作用及机制  学位论文  

[目的]
　　本研究在中医肾主耳藏象理论的指导下，基于TGF-β/Smads信号通路，观察庆大霉素(Gentamicin，GM)慢性肾、耳毒性模型及5/6肾切除残肾模型大鼠肾脏和内耳TGF-β1→TβRⅡ→Smads→α-SMA→ABR及TGF-β→Smads→凋亡→ABR的变化及补肾中药——耳聋左慈丸对模型大鼠的作用，解析耳聋左慈丸补肾治疗耳聋的机制，探讨中医肾主耳的部分分子机制、可能的物质基础及科学内涵。
　　[方法]
　　1.给大鼠肌肉注射GM建立GM慢性肾、耳毒性模型（GM模型）;大鼠5/6肾脏切除建立残肾模型（残肾模型）。
　　2.测定大鼠血液尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酸酐(Serumcreatinine，CREA)，评定肾功能;测定听性脑干反应(Auditory brainstem response，ABR)，评定听功能;对肾功能和听功能做相关性分析。
　　3.采用常规组织切片HE染色法和透射电镜等形态学检查方法，观察大鼠肾脏和内耳的形态学改变。
　　4.采用实时荧光定量PCR(SYBR GreenⅠ)法、蛋白质印迹法(Western blot)等方法，检测TGF-β/Smads信号通路和凋亡信号通路中相关信号因子在肾脏和内耳的表达。
　　5.观察模型大鼠服用耳聋左慈丸后肾功能、听功能、形态学及TGF-β/Smads信号通路及凋亡信号通路中相关信号因子在肾脏和内耳的表达。
　　[结果]
　　1.GM模型大鼠:在肌注GM15天内，BUN和CREA进行性增高，肾组织结构损伤;停GM后，BUN和CREA逐渐恢复，肾间质纤维组织增生，肾功能一定程度的恢复。各频率的ABR阈值均升高，高频ABR阈值升高发生早，程度大(32 kHz＞16 kHz＞8kHz＞4 kHz);停GM后，各频率的ABR阈值继续明显增高，在造模结束后2W听力损害最大，至停GM4 W听力无恢复;内耳毛细胞全部破坏，至停GM4 W，耳蜗Corti器内坏死毛细胞的位置被增生纤维组织充填，外毛细胞无再生。在给GM期间，BUN和CREA与32 kHz ABR阈值呈正相关。
　　残肾模型大鼠:残肾术后BUN和CREA进行性升高，至术后16W，无恢复趋势，肾小球正常结构完全破坏、纤维化，肾小管纤维化。残肾术后8W，8kHz、16 kHz ABR阈值升高，至残肾术后16W，各频率ABR阈值均增高，毛细胞细胞器肿胀。残肾大鼠术后16W内，BUN和CREA的变化与各频率ABR阈值变化呈显著正相关。
　　2.与对照组大鼠比较:GM模型大鼠肾组织TGF-β1和Smad3的mRNA及蛋白表达增多，Smad7的蛋白表达减少;内耳组织TGF-β1和Smad3的mRNA表达增多，Smad7的mRNA表达减少。
　　与假手术组大鼠比较:残肾模型大鼠肾组织和内耳组织TGF-β1和Smad3的mRNA表达增多，Smad7的mRNA表达减少。
　　3.与GM模型组大鼠比较:耳聋左慈丸组大鼠的BUN和CREA降低，肾组织炎症反应和纤维组织增生减轻;各频率ABR阈值降，耳蜗外毛细胞损伤减轻;肾组织TβRⅡ、Smad3、α-SMA的mRNA表达和Smad3的蛋白表达减少，Smad7的mRNA表达增多;内耳组织TGF-β1、TβRⅡ和α-SMA的mRNA表达减少。
　　与残肾模型组大鼠比较:服用耳聋左慈丸12W的残肾大鼠，BUN和CREA降低，肾组织结构损伤减轻;各频率ABR阈值降低，内耳毛细胞细胞器损伤减轻;肾组织的TGF-β1、TβRⅡ、Smad3和α-SMA的mRNA表达减少，Smad7的mRNA表达增加，TGF-β1的蛋白表达减少;内耳组织Smad7的mRNA表达增加。
　　4.与对照组比较:GM模型大鼠肾组织和内耳Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA表达增加，Bcl-2的mRNA表达减少。GM模型大鼠服用耳聋左慈丸6W:肾组织Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA表达减少，Bcl-2的mRNA表达增加，Caspase-3和Bax的蛋白表达减少，Bcl-2的蛋白表达增加;内耳组织Caspase-3和Bax的mRNA表达减少，Bcl-2的mRNA表达增加。
　　与假手术组比较:残肾模型组大鼠肾组织和内耳组织Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达增加，Bcl-2的mRNA表达减少;耳聋左慈丸组大鼠肾组织Bax和Caspase-9的mRNA表达减少，Bcl-2的mRNA和蛋白表达增加;内耳组织Bcl-2的mRNA表达增加，Bax的mRNA表达减少。
　　[结论]
　　1.GM造成大鼠肾功能减退（BUN和CREA显著升高），并使听功能障碍(4、8、16、32 kHz的ABR阈值显著升高)，BUN和CREA的变化与高频ABR阈值变化呈正相关。残肾大鼠术后16W，肾功能的减退与听功能障碍呈正相关。GM模型和残肾模型大鼠的肾功能障碍出现时间均早于听功能障碍。
　　2.GM的肾毒性致大鼠肾组织结构损伤，肾组织TGF-β1和Smad3的mRNA及蛋白表达增加，Smad7的蛋白表达减少。GM的耳毒性致大鼠耳蜗外毛细胞破坏，内耳组织TGF-β1和Smad3的mRNA表达增加，Smad7的mRNA表达减少。
　　残肾模型大鼠术后16W:残肾致肾组织呈纤维化改变、内耳毛细胞细胞器肿胀。肾组织的TGF-β1和Smad3的mRNA表达增加，Smad7的mRNA表达减少;内耳组织Smad3的mRNA表达增加，Smad7的mRNA表达减少。
　　TGF-β/Smads信号通路参与GM和残肾诱发的肾脏和内耳病理的改变、肾功能和听功能减退。
　　3.GM诱发大鼠肾组织和内耳组织凋亡因子Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达增加和Bcl-2的mRNA表达减少，肾组织Bax和Caspase-3的蛋白表达增高，Bcl-2的蛋白表达降低。耳聋左慈丸能调节上述表达。
　　残肾诱发大鼠肾组织和内耳组织Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达增加，Bcl-2的mRNA表达减少;肾组织Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达与其mRNA的表达变化一致。耳聋左慈丸能调节上述表达。
　　线粒体凋亡信号通路参与GM和残肾诱发的肾脏和内耳病理改变、肾功能和听功能减退。耳聋左慈丸有拮抗凋亡的作用。
　　4.耳聋左慈丸可明显改善GM模型大鼠的肾功能和听功能，抑制其肾组织内Smad3、TβRⅡ和α-SMA的mRNA表达，增加Smad7的mRNA表达，抑制肾组织TGF-β1和Smad3的蛋白表达，抑制GM大鼠内耳组织TGF-β1和TβRⅡ的mRNA表达。
　　耳聋左慈丸能改善残肾模型大鼠听功能及肾功能，抑制其肾组织和内耳组织TGF-β1、TβRⅡ和Smad3的mRNA表达，增加Smad7的mRNA表达，抑制肾组织TGF-β1的蛋白表达。
　　耳聋左慈丸可通过调节TGF-β/Smads信号通路起到改善肾功能和听功能的作用。
　　5.耳聋左慈丸通过调节GM和残肾诱发肾脏与内耳相同的TGF-β/Smads信号通路和线粒体凋亡信号通路的变化，可能是耳聋左慈丸同时改善肾脏功能及听功能的作用机制。
　　本实验中观察到两种模型大鼠肾功能障碍均早于听功能障碍出现，补肾中药改善肾功能的同时均改善听功能，进一步探讨了肾主耳的部分机制。