目的:观察活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠大脑、心肌组织全基因表达谱的差异研究,探讨活血潜阳颗粒抑制高血压靶器官损伤的可能机制,为临床应用提供科学依据。
方法：12只20周龄雄性自发性高血压大鼠随机分为模型组、活血潜阳颗粒组,每组6只,同周龄雄性Wistar大鼠6只作为正常对照。活血潜阳颗粒组采用活血潜阳颗粒每只1.92g/kg·天、模型组及正常组给生理盐水每只5ml/kg·天进行灌胃,共8周。采用尾压心率测定仪测定血压;治疗结束后,各组大鼠以水合氯醛腹腔麻醉后,颈动脉取血,断头迅速取出脑组织、心肌组织,用放免法测定大脑组织、心肌组织的AngⅡ、CGRP的含量。提取大脑、心肌组织,然后从大脑组织、心肌组织中提取总RNA,对提取的总RNA质量鉴定合格后,进入芯片检测,先反转录合成第一链cDNA和第二链cDNA,DNA纯化后接着体外转录合成cRNA,然后进行cRNA纯化,之后进行杂交,洗涤,染色,具体过程遵守Agilent公司基因表达谱操作程序。所用芯片是大鼠全基因组芯片,一共44K个探针。应用Agilent芯片扫描仪扫描芯片信号,应用Agilent芯片分析应用软件对芯片灰度扫描图进行分析,将图片的点阵转化为数字型数据,分别得到模型组、活血潜阳颗粒组大脑、心脏组织基因表达谱,按照GeneOntology分类标准,对模型组与活血潜阳颗粒组比较的差异基因进行生物信息学的基因功能显著性分析,从而了解造成活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠大脑、心肌组织生物学差异的靶向性基因功能及其所属基因,并且对这些所属差异基因在活血潜阳颗粒治疗后表达的变化进行分析,另外随机选择差异基因进行荧光定量实验验证基因芯片,选择Wnt、wif-1、Frizzeld、gsk-3β、β-catenin基因作为目的基因,选择GAPDH作为管家基因,引物序列设计软件为primerexpress2.0软件设计,由上海英骏生物技术有限公司进行引物序列合成后,采用ABI7500 FAST型荧光定量PCR仪,进行荧光定量RT-PCR检测,观察熔解曲线和扩增曲线,使用相对定量ΔΔCt法进行数据分析,验证芯片结果的准确性。
结果：(1)与Wistar大鼠比较,20周龄SHR大鼠收缩压明显升高(P＜0.01);8周后,模型组大鼠收缩压明显较20周龄时明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,活血潜阳颗粒组收缩压明显下降(P＜0.01)。20周龄自发性高血压大鼠心率,与同周龄的Wistar大鼠相比明显增快(P＜0.01),模型组、活血潜阳颗粒组大鼠心率的前后比较表明,心率无明显改变(P＞0.05)。
(2)自发性高血压大鼠血、大脑、心肌内AngⅡ含量,与同周龄的Wistar大鼠相比明显升高(P＜0.01),活血潜阳颗粒组较自发性高血压大鼠模型组明显下降(P＜0.05),活血潜阳颗粒组与同周龄的Wistar大鼠相比无明显差异(P＞0.05)。说明活血潜阳颗粒有明显降低外周血液、大脑、心肌内的.AngⅡ含量。
(3)自发性高血压大鼠大脑、心肌组织内CGRP含量,与同周龄的Wistar大鼠相比明显下降(P＜0.05,P＜0.01),活血潜阳颗粒组较自发性高血压大鼠模型组明显上升(P＜0.01,P＜0.05),活血潜阳颗粒组与同周龄的Wistar大鼠相比无明显差异(P＞0.05)。说明活血潜阳颗粒有明显升高SHR大脑、心肌组织的CGRP含量的作用。
(4)2组大鼠脑组织基因表达的差异
自发性高血压大鼠SHR模型组作SHR活血潜阳颗粒组的对照组,将三个芯片结果进行生物学重复,结果两种荧光信号的比值小于0.5或大于2.0的基因有1290个,其中下表达的基因有611个,361个能在Genbank上登陆;上表达的基因679个,360个基因能在Genbank上登陆。其中涉及的有信号转导、代谢、细胞发育与功能、应激、免疫等相关基因。其中活血潜阳颗粒对Wnt、JAK-STAT、MAPK等信号传导通路相关基因的干预可能在防治高血压慢性脑损害的发生、发展过程中起着重要的作用。
(5)2组大鼠心肌组织基因表达的差异
选择自发性高血压大鼠SHR模型组作SHR活血潜阳颗粒组的对照组,将三个样品充分混匀,行两个对比芯片结果进行检测,结果两种荧光信号的比值小于0.5或大于2.0的基因有1780个,其中下表达的基因有994个,522个能在Genbank上登陆;上表达的基因786个,409个基因能在Genbank上登陆。涉及的有与信号转导、代谢、细胞发育与功能、细胞间紧密连接、增殖、分子信号传递和传导活性等基因。活血潜阳颗粒对Wnt、Hedgehog、PPARs等信号传导通路相关基因的干预可能在防治高血压慢性心肌损害的发生、发展过程中起着重要的作用。
(6)荧光定量RT-PCR实验
对大脑组织、心肌组织中Wnt、Wif-1、Fzd、Gsk3β、β-catenin基因进行荧光定量RT-PCR实验。基因表达的变化与芯片结果一致,表明芯片结果可靠。
结论：
1活血潜阳颗粒能显著降低SHR收缩压及血、大脑、心肌.AngⅡ的含量,并上调大脑、心肌中CGRP的含量。证明活血潜阳颗粒具有抗高血压作用。
2在全基因组学水平证明活血潜阳颗粒可以延缓高血压心、脑靶器官损害,揭示活血潜阳颗粒延缓脑损害及心肌损害的相关反应性基因。
3对大脑组织、心脏组织中部分基因进行荧光定量RT-PCR实验。基因表达的变化与芯片结果一致,芯片结果可靠。
本研究首次利用现代科学全基因组基因芯片技术研究活血潜阳颗粒治疗SHR后大鼠大脑、心肌组织基因表达谱的变化,为活血潜阳颗粒中药保护高血压靶器官损害在全基因组学方面提供新的理论依据。
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