黄药子肝毒性-抗肿瘤活性的物质基础及作用机制研究  学位论文  

背景:黄药子在现代临床上除主要用于甲状腺疾病外,也多用于胃癌、肝癌、乳腺癌等多型癌症的治疗。由于黄药子具有突出的药用价值,使其临床应用增多,在获得可靠疗效的同时也发现该药对肝脏具有一定的毒性,严重限制了其在临床中卓越疗效的发挥和应用。目前,黄药子肝毒性.抗肿瘤活性的物质基础及作用机制,临床用药存在安全隐患。
　　 目的:本论文的研究旨在阐明黄药子肝毒性.抗肿瘤活性的物质基础及作用机制,为黄药子的临床安全、有效应用提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.通过急性毒性试验筛选黄药子的毒性部位。
　　 2.通过对肝损伤血清生化指标分析及肝组织病理观察,研究黄药子肝毒性及当归、五味子对其解毒作用;通过肝组织氧化应激系统指标的分析探讨黄药子肝毒性机制及当归、五味子对其肝毒性的解毒机制。
　　 3.通过荷瘤小鼠肿瘤模型,确定黄药子抗肿瘤活性部位及物质基础,研究当归、五味子对黄药子抗肿瘤活性的影响;并通过对动物脾脏和胸腺相对重量及外周血白细胞及其分类的测定分析,探讨黄药子抗肿瘤活性的初步作用机制。
　　 4.通过毒性、活性实验结合中药化学分析手段进行相关性分析,阐明黄药子肝毒性-抗肿瘤活性的物质基础。
　　 5.通过MTT法,从当归、五味子中筛选能拮抗黄独素B(Diosbulbin B,DB)肝细胞毒性的化合物。
　　 6.通过HPLC测定黄药子中DB、当归阿魏酸(Fcrulic acid,FA)、五味子6种木质素类成分的含量,以保障本研究所用药材的可靠性和实验的可重复性。
　　 结果：
　　 1.急性毒性试验结果发现,黄药子标准醇提物(Ethanol extract,ET)及其乙酸乙酯部位(EF)的LD50(半数致死量)分别为3,800和922.4 mg/kg。
　　 2.血清生化指标分析发现,分别连续给予ET、EF、DB14或12 d,或单次给予EF和DB,均可诱导小鼠血清肝损伤指标ALT(谷丙转氨酶)和AST(谷草转氨酶)水平明显升高(P＜0.05),且在单次给予EF(640 mg/kg)后12 h,雄性(Male)动物的ALT和AST。水平明显高于雌性(Female)的(P＜0.05);DB分别单次ig和尾静脉注射(iv)给药后24 h,均可使小鼠血清ALT和AST水平明显升高(P＜0.05);中药当归标准醇提物(AE)、五味子标准醇提物(SE)及阿魏酸(Ferulic acid,FA),均可明显拮抗由ET或DB诱导的小鼠血清ALT和AST水平的升高(P＜0.05)。进一步肝组织病理观察发现,DB(32 mg/kg)连续给药12d可诱导小鼠肝病理性损伤,而FA对之有保护作用。
　　 3.氧化应激指标分析发现,EF和DB均可诱导小鼠肝LPO(脂质过氧化)水平过高(P＜0.05),同时降低肝内谷胱甘肽含量、谷胱甘肽相关酶GPx(谷胱甘肽过氧化物酶)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶),GR(谷胱甘肽还原酶),GCL(谷氨酸半胱氨酸连接酶)及抗氧化酶SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)的活力(P＜0.05),且在给予EF12 h时,雄性动物的肝谷胱甘肽和CAT水平均明显低于雌性的(P＜0.05):而AE、SE或FA可明显拮抗由ET或DB诱导的肝过高的LPO水平、耗竭的谷胱甘肽含量、以及过低水平的谷胱甘肽相关酶及抗氧化酶水平;进一步研究发现,FA还可上调由DB诱导而被下调的肝CAT蛋白表达水平以及CAT、CuZn SOD基因表达水平(P＜0.05)。
　　 4.ET、EF和DB分别连续ig给药14 d(DB为12 d)均可使荷瘤S180肉瘤实体瘤瘤重显著降低(P＜0.05),其中ET还可使小鼠肝癌H22实体瘤瘤重明显降低(P＜0.05);DB分别ig和iv给药,均可使荷瘤小鼠瘤重明显降低,且二者作用相当;ET、EF和DB抗S180实体瘤活性的ED50(半数有效剂量)分别为159,26.8,2.5 mg/kg。进一步研究发现,EF还可明显升高S180荷瘤小鼠过低的胸腺相对重量和外周血淋巴细胞(Lymphocyte)数(P＜0.05)、降低过高的脾相对重量和外周血白细胞(Leukocytes)及其中性粒细胞(Neutrophil)数(P＜0.05)。
　　 5.AE和SE均能增强ET的抗肿瘤作用(P＜0.05)。进一步研究发现,当归所含的阿魏酸(Ferulic acid,FA)能明显增强DB的抗肿瘤作用(P＜0.05),而其中所含的Z-藁本内酯(Z-ligustilid,Lig)对此没有明显影响(P＞0.05)。
　　 6.DB可明显抑制小鼠原代肝细胞的增殖(P＜0.05),其IC50(半数抑制浓度)为143.8μM;1μM的五味子丙素(Schizandrin C)和50μM的五味子醇甲(Schizandrol A)、五味子醇乙(Schizandrol B)、五味子酯甲(Schisantherin A)均可明显逆转DB(50μM)对小鼠原代肝细胞增殖的抑制(P＜0.05),其中以Schizandrin C作用最强,而五味子甲素(Schizandrin A)、五味子乙素(Schizandrin B)、FA和Lig均对此没有明显影响(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.ET和EF为黄药子的急性毒性部位,其急性毒性主要表现为肝毒性,二者当中含量较高的DB是黄药子肝毒性主要的物质基础;EF、DB连续或单次给药的肝毒性机制主要由于其降低了肝内主要的抗氧化酶SOD、CAT的活力、蛋白及基因的表达,同时破坏了肝内谷胱甘肽抗氧化系统的平衡,从而诱导了肝组织的氧应激损伤。此外,黄药子诱导的肝毒性具有明显的剂量依赖性、时间依赖性和性别差异的特点,提示黄药子在临床用药时应注意剂量和给药时间,并对不同性别的患者区别对待。
　　 2.ET和EF均有抗肿瘤活性,二者当中含量较高的DB是黄药子抗肿瘤活性主要的物质基础;黄药子抗肿瘤活性的作用机制可能与其对免疫的调节活性有关。
　　 3.黄药子抗肿瘤活性与其肝毒性主要在同一部位(ET、EF)同一成分(DB);ET、EF和DB抗肿瘤活性的安全有效的剂量范围分别为100～800 mg/kg、10～80mg/kg、2～16 mg/kg,折合到黄药子原药材约为905～7240 mg/kg。
　　 4.当归和五味子对黄药子均有解毒增效作用。其中,FA是当归对DB解毒增效的物质基础之一,五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲均是五味子拮抗DB肝细胞毒性的物质基础。此外,当归、五味子对黄药子的解毒机制与其拮抗黄药子诱导的氧化应激肝损伤有关。